本发明专利技术公开了优化的甘露聚糖酶基因及其重组植物表达载体和应用。本发明专利技术将甘露聚糖酶基因通过密码子优化以及提高mRNA二级结构稳定性等措施得到SEQ?ID?NO.1所示的优化甘露聚糖酶基因；本发明专利技术进一步构建了含有原始甘露聚糖酶基因或优化甘露聚糖酶基因的重组植物表达载体并将其转化到玉米中筛选得到种子中高效表达甘露聚糖酶的转甘露聚糖酶基因玉米植株；酶学性质测定表明，优化的甘露聚糖酶基因能在玉米中稳定、高效的表达及遗传，所表达的甘露聚糖酶酶活以及稳定性显著高于原始甘露聚糖基因在玉米中所表达的甘露聚糖酶的酶活及稳定性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及优化的甘露聚糖酶基因以及含有该优化基因的重组植物表达载体，本专利技术进一步涉及它们在制备表达甘露聚糖酶转基因植物中的应用，属于转基因植物领域。
技术介绍
甘露聚糖是植物半纤维素的主要成份之一，以β -I, 4-D-吡喃甘露糖苷键连接而成的线性多糖，分为甘露聚糖、葡萄甘露聚糖、半乳甘露聚糖。在饲料作物(如麦类、豆柏、玉米)中不能被单胃动物分解，是目前大量应用的玉米/豆柏型饲料中主要的抗营养因子。它们能结合大量的水，使采食动物消化道中食糜的体积增大、粘度增加、养分与消化道内源酶的作用降低、营养物质的消化率下降。造成动物生长受阻、饲料转化率降低，从而使其代谢受到抑制(Liepman AH, et al. , Plant Physiol 143:1881β-甘露聚糖酶(EC3. 2. 1.78):水解β _1，4_D_吡喃甘露糖为主链的内切水解酶，作用底物主要是甘露聚糖、半乳甘露聚糖、葡萄甘露聚糖、以及半乳葡萄甘露聚糖。主要来源于低等动物、植物、微生物，微生物来源的β_甘露聚糖酶具有活力高、成本低、来源稳定、提取方便等明显优点，已在实际生产和基础研究中得到广泛应用。在饲料行业上的应用，有如下功效降解甘露聚糖为甘露寡糖，降低抗营养作用；甘露寡糖具有免疫原性，刺激和增强免疫反应；调控动物胃肠道微生态环境，促进有益菌生长，抑制有害菌黏附能(McCleary BV, Method Enzymol 160:596现在生产上通常需要添加甘露聚糖酶制剂来改善动物对饲料的利用效率，减轻动物黏性粪便造成的环境污染问题。已经利用微生物发酵进行饲用甘露聚糖酶的产业化生产，并在饲料工业中广泛应用。利用转基因植物生产饲用酶，其优势在于1)转基因植物尤其是转基因玉米用作饲料原料，可以直接饲喂，而省去目前酶制剂的发酵生产和添加过程；2)生产规模不受限制，成本比较低。农作物的生产、运输、加工和贮藏等各种基础设施及技术早已具备，转基因植物高水平表达生产重组蛋白可以通过大规模种植来完成；3)目前初步的研究发现，在植物，尤其是种子中表达的非淀粉多糖酶具有更好的贮存稳定性和抗逆性；4)安全性好，用微生物发酵生产酶制剂，细胞培养过程中污染极其普遍，但在植物表达系统中没有这种污染。玉米为“饲料之王”，是中国最主要的能量饲料粮之一，也是畜禽生产肉、蛋、奶的重要来源，其用量占配合饲料成份的60-70%玉米籽粒作为动物饲料最主要的成分，在作为生物反应器这一层面上，与其它饲料作物相比，转基因玉米有更好的经济效益和应用前景。随着畜牧业的发展和新技术的综合应用，玉米已成为最重要的粮食、饲料和经济兼用作物。所以，加强优质、专用和资源高效饲用型玉米新品种的培育和推广具有十分重要的现实意义。来源于Bispora sp. MEY-1的甘露聚糖酶具有较优良的酶学性质(Luo H, etal. , Appl Microbiol Biotechnol 82:453-461，2009)。它是目前分离到的比较好的能适用于饲料产业中的酸性甘露聚糖酶，但是该酶在玉米等农作物中表达仍然存在表达效率低、稳定性差等缺陷。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供一种能够在玉米等农作物种子中高效表达、稳定性好的优化的甘露聚糖酶基因；本专利技术的目的之二是提供含有原始甘露聚糖酶基因或优化的甘露聚糖酶基因的重组植物表达载体；本专利技术的目的之三是提供一种制备表达甘露聚糖酶转基因植物的方法。本专利技术的上述目的是通过以下技术方案来实现的·为了提高甘露聚糖酶基因在作物(尤其是玉米)中的表达效率和稳定性，本专利技术将来源于 Bispora sp. MEY-1 的原始甘露聚糖酶基因(MAN5A_SST)(SEQ ID NO. 2XEU919724)通过密码子优化以及提高mRNA二级结构稳定性等措施，得到SEQ ID NO. I所示的优化的甘露聚糖酶基因(MAN5AS)。本专利技术的另一目的是提供一种含有原始甘露聚糖酶基因或优化的甘露聚糖酶基因的重组植物表达载体，该重组植物表达载体包括启动子序列、原始甘露聚糖酶基因或优化的甘露聚糖酶基因，信号肽和蛋白体定位序列以及终止子序列。其中所述的启动子可以为单子叶植物组成型启动子，如Ubi启动子或CaMV35S启动子，也可以是单子叶植物诱导型启动子，还可以是单子叶植物组织特异性启动子；所述的玉米胚特异表达的启动子和终止子可分别根据GenBank登记号L22344和L22345设计引物，分别扩增得到来自于玉米基因组DNA中玉米胚芽蛋白的启动子和终止子片段。所述的玉米胚乳特异表达的启动子和终止子序列可根据文献(Woo, et al. 2001，Plant cell.Oct. 13(10) :2297-317)来设计引物分离得到。优选的，本专利技术中所述的启动子序列是专利申请公开号为CN 101153285A (专利技术名称为“一种表达植酸酶的转基因植物的制备方法”)的中国专利技术专利申请文件中所公开的SEQ ID NO. 3或SEQ ID NO. 5所示的核苷酸序列。所述的优化的甘露聚糖酶基因的核苷酸序列为SEQ ID NO. I所示；所述的原始甘露聚糖酶基因的核苷酸序列为SEQ ID NO. 2所示。所述的信号肽和蛋白体定位序列可以是专利申请公开号为CN 101153285A (专利技术名称为“一种表达植酸酶的转基因植物的制备方法”)的中国专利技术专利申请文件中所公开的SEQ ID N0.9所示的核苷酸序列(引导基因产物分泌和定位的信号肽序列，控制基因产物的定位，该信号肽和蛋白体定位序列可以引导植酸酶定位到细胞的蛋白体中)。所述的终止子序列可以是专利申请公开号为CN 101153285A (专利技术名称为“一种表达植酸酶的转基因植物的制备方法”)的中国专利技术专利申请文件中所公开的SEQ IDNO 4或SEQ ID NO :6所示的序列。本专利技术的再一目的是提供一种制备表达甘露聚糖酶的转基因植物的方法，该方法包括以下步骤(I)构建含有SEQ ID NO. I或SEQ ID NO. 2所示基因的重组植物表达载体；(2)将所构建的重组植物表达载体转化到受体农作物中，筛选获得高效表达甘露聚糖酶的转基因植物。优选的，步骤(I)中所述的重组植物表达载体的构建方法包括将信号肽和蛋白体定位序列，SEQ ID NO. I或SEQ ID NO. 2所示的甘露聚糖酶基因和终止子序列连接在一起后，可操作的连接到启动子序列之后。作为一个具体的实施方案，可以将SEQ ID NO. I所示的基因可操作的与植物表达载体pHP20754连接，即得到能在玉米等植物中高效表达甘露聚糖酶的重组植物表达载体；其中，所述植物表达载体PHP20754的构建方法已在专利申请公开号为CN101153285A (专利技术名称为“一种表达植酸酶的转基因植物的制备方法”)的中国专利技术专利申请文件中详细公开。其中，所述“可操作的连接”是指两个或更多个元件之间功能性的连接，可操作连接的元件可为邻接或非邻接的；所述的植物表达载体可以由Y端非编码区，SEQID No. I 所示的核苷酸和3'非编码区组成，其中，所述的5'端非编码区可以包括启动子序列、增强子序列或/和翻译增强序列；所述的启动子可以是组成性启动子、诱导型启动子、组织或器官特异性启动子；所述的3'非编码区可以包本文档来自技高网...
【技术保护点】
优化的甘露聚糖酶基因，其特征在于：其核苷酸序列为SEQ？ID？NO.1所示。
【技术特征摘要】
1.优化的甘露聚糖酶基因，其特征在于其核苷酸序列为SEQID NO. I所示。2.含有权利要求I所述优化的甘露聚糖酶基因的重组表达载体；优选的，所述重组表达载体是重组植物表达载体。3.—种重组植物表达载体，其特征在于，包括启动子序列、原始的甘露聚糖酶基因或权利要求I所述的优化的甘露聚糖酶基因，信号肽和蛋白体定位序列以及终止子序列。4.按照权利要求3所述的重组植物表达载体，其特征在于所述的启动子为单子叶植物组成型启动子、单子叶植物诱导型启动子或单子叶植物组织特异性启动子。5.一种构建权利要求3或4所述重组植物表达载体的方法，包括将信号肽和蛋白体定位序列，原始的甘露聚糖酶基因或权利要求I所述的优化的甘露聚糖酶基因和终止子序列连接在一起后，可 呆作的连接到启动子序列之后。6.一种制备表达甘露聚糖酶的转基因植物的方法，该方法包括以下步骤 (1)构建含有原始甘露聚糖酶基因或权利要求I...
【专利技术属性】
技术研发人员：姚斌，杨培龙，孟昆，张宇宏，徐晓露，袁建华，陈茹梅，孟庆长，张伟，
申请(专利权)人：中国农业科学院饲料研究所，
类型：发明
国别省市：
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