本发明专利技术涉及一种β-甘露聚糖酶的高产方法，本方法是通过将一个编码为内切β-甘露聚糖酶的多核苷酸被化学合成、克隆以及与a-因子信号肽结合后在胞外表达(受到乙醇氧化酶基因AOX1启动子的控制)等过程。在一个500L的生物反应器中，所选的高表达工程菌株能分泌大约4g/L蛋白至培养液中，高表达菌株能产生约4305U/mL的β-甘露聚糖酶酶活。Co2+和Mn2+能显著增强甘露聚糖的水解活性。产生的β-甘露聚糖酶能高效水解甘露聚糖、葡甘露聚糖和半乳甘露聚糖。
【技术实现步骤摘要】
本技术属于生物
，提供了，以及β -甘露聚糖酶水解甘露聚糖、葡甘露聚糖和半乳甘露聚糖的应用。
技术介绍
植物细胞壁包含2种主要的多糖纤维素和半纤维素。由β -1,4-D-糖苷键连接的半纤维素主要由甘露聚糖组成。甘露聚糖大部分存在于初级植物细胞壁中，在次级细胞壁中含量较少。全世界每年产生大量含有甘露聚糖的农业废弃物。在东南亚，每年产生数百万吨含有甘露聚糖的棕榈仁饼。在南美洲，咖啡产业和椰子油产业产生数百万吨的咖啡废物和椰子饼。棕榈仁饼、椰子饼由于富含甘露聚糖等抗营养因子，只能作为低级的反刍动物饲料。β -甘露聚糖酶是一类能够水解含β-1，4-甘露糖甘键的甘露寡糖和甘露多糖 (包括甘露聚糖、半乳甘露聚糖、葡甘露聚糖等)的内切水解酶。甘露聚糖酶处理过的棕榈仁饼和椰子饼已经显示出良好的饲料价值，可以在畜禽饲料中使用。另外，甘露聚糖酶在造纸业和去污剂行业已经有良好的作用。当用包含甘露聚糖的生物材料生产生物燃料成为现实以后，甘露聚糖酶会越来越重要。毕赤酵母是一种甲基营养性酵母，能在普通培养基中产生较高细胞密度。它优良的表达系统可以产生大量的酶和蛋白质，比如,葡聚糖酶、木聚糖酶、鞣酸酶、植酸酶和甘露聚糖酶。现有技术中，生产甘露聚糖酶的技术如下PCT W0/1999/024588公布了一个来源于番茄的具有编码β-甘露聚糖内切酶的cDNA克隆体，用启动子过度表达这个基因可以加快果实的成熟。PCT W0/1993/024622公布了一个编码甘露聚糖内切酶的木霉的DNA序列，并将其导入到酵母或者真菌，诱导产生甘露聚糖内切酶，也是一种分离编码甘露聚糖内切酶基因的方法。PCT W0/2006/126589公布了蜗牛，尤其是太平洋鲍鱼，产生的一种甘露聚糖酶的特性，以及适用于水产领域大量生产酶制剂的技术。PCT W0/2008/062317公布了咖啡豆产生的β-甘露聚糖酶、编码该蛋白的多核苷酸、表达系统以及含有该多核苷酸的宿主细胞。PCT W0/2001/098462和美国专利6，984，406公布了一株可产生在中性和酸性培养基中表现高酶活的甘露聚糖酶的芽孢杆菌菌株。甘露聚糖酶在饲料中用作添加剂，在半纤维素的分解中有很好的作用。PCT W0/2004/113538公布了一个地衣芽孢杆菌WL-12的编码甘露聚糖酶的新基因，一个携带这个基因的重组质粒以及一个包含重组质粒的大肠杆菌转化体。甘露聚糖酶把半乳甘露糖降解为甘露糖、甘露二糖和甘露三糖，酶在中性PH值和适当温度条件下具有较高的活性，这个条件是动物生理条件相近。PCT W0/2003/012110 和美国专利 7,112,429 公布了 Acidothermuscellulolyticus产生的耐热甘露聚糖酶。此项专利技术进一步公布了制造ManA重组型的方式以及酶制剂在食品加工和食品添加剂中的应用。PCT W0/1994/025576公布了棘孢曲霉CBS. 101. 43.产生的能表现甘露聚糖酶活的酶，认为这种酶用于降解或者改良植物或藻类细胞壁材料。PCT W0/2008/009673揭示了一个野生型里氏木霉产生的甘露聚糖酶的突变体及其核酸和氨基酸序列，该突变体插入、删除和/或替代了一段氨基酸，具有更高的热稳定性、蛋白水解稳定性、比活性、低PH条件下的稳定性。PCT W0/2000/077155,W0/1999/009126,ff0/2000/042146,and W0/1999/009128 公布了一个包含甘露聚糖酶的配方，提高对于食品、化妆品脏污以及增白剂可能更好的清洁性能。PCT W0/1995/014809公布了用甘露聚糖酶制备漂白纤维素纸浆的工艺。·PCT W0/2001/062951 and W0/2001/064932公布了一个用乳化剂和甘露聚糖酶复合处理椰子柏生产改性椰子柏的工艺。通过这种方法，可以有效、经济的释放甘露聚糖。PCT W0/2001/064830公布了一个含有纤维素内切酶、木聚糖酶、β -甘露聚糖酶和/或α-淀粉酶的复合酶制剂处理方木中酿酒单宁酸的工艺。PCT W0/2003/062409公布了一个针对动物饲料的至少含有2种耐热酶的配方，这2种酶是从葡聚糖内切酶，木聚糖酶，植酸酶，蛋白酶，半乳聚糖酶，甘露聚糖酶，聚糖酶，a_半乳糖苷酶中筛选出来的。首选的木聚糖酶从曲霉，芽孢杆菌属，腐质霉属，茶毒菌属和木霉属分离获得。PCT W0/1996/036569公布了 I个阻止或者去除表面生物膜的配方，其中至少含有甘露聚糖酶，选择性地和糖酶、蛋白酶、脂肪酶以及糖蛋白酶中的至少一种组合。PCT W0/2001/075084公布了从咖啡中获得的至少可以编码一种酶的DNA片段，这个酶可以水解由直链或支链甘露聚糖通过1，4_糖苷键连接组成的多糖。PCT W0/1994/020667公布了一种用酶预处理木材原材料的工艺，本处理可以减少机械打浆的能耗，提高纤维的性能，所用的酶为纤维二糖水解酶和甘露聚糖酶。PCT W01998/020750公布了甘露聚糖酶制剂在提高饲料植物蛋白原料价值的应用。PCT W0/1997/041739公布了在低能饲料中添加半纤维素酶(如甘露聚糖酶)提高单胃动物能量利用率的方法。PCT W0/2005/003319 and PCT W0/2007/095398 公布了甘露聚糖酶活性的多肽。美国专利7，148，399公布了从咖啡中获得的至少可以编码一种酶的DNA片段，这个酶可以水解由直链或支链甘露聚糖通过I，4-糖苷键连接组成的多糖。美国专利6，566，114公布了由芽孢杆菌1633基因编码的新的甘露聚糖酶。该甘露聚糖酶为碱性，可用作清洗剂成分，以及用在压裂液中用于压裂地层，用于改良植物材料，以及用于处理纤维织物。美国专利6，060，299公布了一个枯草芽孢杆菌168多核苷酸分子编码产生的新甘露聚糖酶。该甘露聚糖酶为碱性，可用作清洗剂成分，用于改良植物材料，以及用于处理纤维织物。美国专利4，895，800描述了克隆载体；毕赤酵母中甲醇诱导启动子的使用以及变性蛋白的表达。有关在毕赤酵母中蛋白表达平台的信息，比如，启动子、转化方法等，在美国专利 4，683，293 ;4，808，537 ;4，812，405 ;4，818，700 ;4，837，148 ;4，855，231 ;4，857，467 ；4，879，231 ;4，882，279 ;4，885，242 ;4，929，555 ;5，002，876 5，004，688 5，032，516 ；5，122，465 ;5，135，868 ;5，166，329 中可以见到。
技术实现思路
首先，本专利技术提供了一种β -甘露聚糖酶的高产方法。包括以下步骤(I) 一种合成的甘露聚糖酶基因与DNA载体中的启动子结合，产生一个表达框；(2)将DNA载体接种到一个酵母细胞中，接种的酵母是巴斯德毕赤酵母，属于毕赤酵母属；(3)小规模培养条件下，通过测定β_甘露聚糖酶活性筛选出高表达菌株；(4)在500L的生物反应器中，筛选高表达甘露聚糖酶的菌株，高表达甘露聚糖酶的菌株产生4305U/mL的β -甘露聚糖酶酶活。 表达框由一个指示β -甘露聚糖酶分泌到细胞外培养液中的信号肽组成。首选的信号肽是α -因子，β -甘本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种生产β？甘露聚糖酶的方法，包括以下步骤：(1)一种合成的β？甘露聚糖酶基因与DNA载体中的启动子结合，产生一个表达框，(2)将DNA载体接种到一个酵母细胞中，(3)小规模培养条件下，通过测定β？甘露聚糖酶活性筛选出高表达菌株，(4)在500L的生物反应器中，筛选高表达β？甘露聚糖酶的菌株
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：项文胜，王俊峰，李尚坤，
申请(专利权)人：江苏奕农生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：
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