新的甘露聚糖酶制造技术

包含例如ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ：２的第３１－３３０位所示氨基酸序列的新的甘露聚糖酶或它们的同源物，可以由例如芽孢杆菌１６３３得到，或者可以由下列多核苷酸分子编码：包含ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ：１的第９１－９９０位所示核苷酸序列的多核苷酸分子、编码与ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ：２的第３１－３３０位所示氨基酸序列至少６５％相同的多肽的多核苷酸分子、或它们的简并核苷酸序列。该甘露聚糖酶是碱性的，而且非常有用，如，在清洁组合物中使用，在压裂液中用来裂解地下结构，用于修饰植物材料，和用于处理纤维素质纤维。（*该技术在2019年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及微生物甘露聚糖酶，尤其是在中性和碱性pH范围内具有甘露聚糖酶活性作为其主要酶活性的微生物酶；生产这些酶的方法；和在纸张和纸浆、纺织品、石油钻探、清洁、洗涤衣物、洗涤剂和纤维素纤维加工业中，使用这些酶的方法。
技术介绍
含有甘露聚糖的多糖是木材、许多豆科种子胚乳、和一些非豆科植物成熟种子中，半纤维素部分的主要成分。基本上未取代的线性β-1，4-甘露聚糖在一些非豆科植物中发现存在。例如，象牙棕榈果实中存在的未取代β-1，4-甘露聚糖在单个多糖链的构象方面与纤维素相似，而且不溶于水。在豆科种子中，水溶性半乳甘露聚糖是主要贮藏糖类，占总干重的多至20％。半乳甘露聚糖的线性β-1，4-甘露聚糖主链有单个α-1，6-半乳糖取代，任选有乙酰基取代。甘露聚糖还在多种单子叶植物中发现，而且是棕榈仁粉细胞壁物质中含量最丰富的多糖。葡甘露聚糖是具有β-1，4连接(以或多或少的规则方式交替出现)的甘露糖和葡萄糖主链的线性多糖，主链任选有半乳糖和/或乙酰基取代。甘露聚糖、半乳甘露聚糖、葡甘露聚糖和半乳葡甘露聚糖(即具有分支半乳糖的葡甘露聚糖主链)占软木半纤维素的50％以上。此外，许多红藻的纤维素中含有大量的甘露糖。已经在多种芽孢杆菌生物体中鉴定了甘露聚糖酶。例如，Talbot等人(应用环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)，56(11)3505-3510(1990))描述了由嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)得到的β-甘露聚糖酶，其二聚体形式具有分子量162kDa，最适pH5.5-7.5。Mendoza等人(世界微生物学和生物技术杂志(World J.Microbiol.Biotech.)，10(5)551-555(1994))描述了由枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)得到的β-甘露聚糖酶，具有分子量38kDa，在pH5.0和55℃具有最大活性，pI4.8。JP-A-03047076公开了由一种芽孢杆菌得到的β-甘露聚糖酶，具有分子量37±3kDa(通过凝胶过滤测量)，最适pH8-10，pI5.3-5.4。JP-A-63056289描述了碱性、热稳定的β-甘露聚糖酶的生产，该酶水解例如甘露聚糖的β-1，4-D-吡喃甘露糖苷键，并产生甘露寡糖。JP-A-63036775涉及在碱性pH产生β-甘露聚糖酶和β-甘露糖苷酶的芽孢杆菌微生物FERM P-8856.JP-A-08051975公开了来自嗜碱性芽孢杆菌AM-001的几种碱性β-甘露聚糖酶，其具有分子量43±3kDa和57±3kDa，最适pH8-10。WO97/11164中公开了一种可用于漂白纸浆和纸张，来自解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的纯化甘露聚糖酶及其制备方法。WO91/18974描述了在极端pH和温度下有活性的半纤维素酶，诸如葡聚糖酶、木聚糖酶或甘露聚糖酶。WO94/25576公开了来自棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)CBS101.43的酶，其具有甘露聚糖酶活性，可用于降解或修饰植物或藻类细胞壁物质。WO93/24622公开了由Trichoderma reseei分离得到的甘露聚糖酶，其可用于漂白木质纤维素(Lignocellulosic)纸浆。WO95/35362公开了含有植物细胞壁降解酶(具有果胶酶和/或半纤维素酶以及任选有纤维素酶活性)、用于除去植物来源的污渍的清洁组合物，还公开了来自菌株C11SB.G17的碱性甘露聚糖酶。本专利技术的一个目的是提供新的和有效的、在碱性pH范围内(例如应用于清洁组合物或不同的工业加工中)仍具有甘露聚糖酶活性的酶。专利技术概述专利技术人现在已经发现了具有实质性甘露聚糖酶活性的新酶，即可以由芽孢杆菌属的细菌菌株得到、具有甘露聚糖酶活性的酶，而且已经成功的鉴定了编码这些酶的DNA序列。DNA序列在序列表中列出，分别为SEQ ID NO1，5，9，11，13，15，17，19，21，23，25，27，29和31；而且推导的氨基酸序列也在序列表中列出，分别为SEQ ID NO2，6，10，12，14，16，18，20，22，24，26，28，30和32。相信新酶根据酶命名法将归类为酶类EC 3.2.1.78。在第一个方面，本专利技术涉及甘露聚糖酶，它是i)由芽孢杆菌I633产生的多肽，ii)包含SEQ ID NO2的第31-330位所示氨基酸序列的多肽，或iii)与i)或ii)定义的多肽至少65％同源，由该多肽通过取代、删除或加入一个或几个氨基酸衍生得到，或与针对该多肽(经纯化的形式)制备的多克隆抗体可发生免疫学反应的所述多肽类似物。在一个方面中，本专利技术提供了选自下组的分离多核苷酸分子(a)编码具有甘露聚糖酶活性的多肽、并包含SEQ ID NO1的第91-990位核苷酸所示核苷酸序列的多核苷酸分子；(b)(a)的物种同源物；(c)编码具有甘露聚糖酶活性、与SEQ ID NO2的第31-330位氨基酸残基所示氨基酸序列至少65％相同的多肽的多核苷酸分子；(d)与(a)、(b)或(c)互补的分子；和(e)(a)、(b)、(c)或(d)的简并核苷酸序列。已经将质粒pBXM3转化到大肠杆菌菌株中(质粒pBXM3包含编码本专利技术甘露聚糖酶的多核苷酸分子(DNA序列))，依照国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约，专利技术人于1998年5月29日将此菌株保藏于Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH，Mascheroder Weg 1b，D-38124 Braunschweig，德国，保藏号DSM 12197。在本专利技术的另一个方面中，提供了包含下列可操作连接在一起的元件的表达载体转录启动子；选自下组的DNA片段(a)编码具有甘露聚糖酶活性的多肽、并包含SEQ ID NO1的第91-990位核苷酸所示核苷酸序列的多核苷酸分子；(b)(a)的物种同源物；(c)编码具有甘露聚糖酶活性、与SEQ ID NO2的第31-330位氨基酸残基所示氨基酸序列至少65％相同的多肽的多核苷酸分子；和(d)(a)、(b)或(c)的简并核苷酸序列；和转录终止子。在本专利技术的还有一个方面中，提供了已经导入了上述表达载体的培养细胞，其中该细胞表达该DNA片段编码的多肽。本专利技术的其它方面提供了具有甘露聚糖酶活性的分离多肽，其选自(a)包含SEQ ID NO2的第31-330位氨基酸残基所示氨基酸序列的多肽分子；(b)(a)的物种同源物；和具有甘露聚糖酶活性的融合蛋白，其包含的第一多肽部分具有甘露聚糖酶活性，而第二多肽部分具有纤维素结合功能，第二多肽优选是纤维素结合结构域(cellulose binding domain，CBD)，诸如SEQ ID NO4描绘的融合蛋白。在本专利技术的另一个方面中，提供了包含本专利技术的纯化多肽与其它多肽的组合物。在本专利技术的另一个方面中，提供了生产本专利技术多肽的方法，包括培养已经导入了上述表达载体的细胞(从而该细胞表达该DNA片段编码的多肽)和回收多肽。本专利技术的新酶可以用于处理纤维素物质，尤其是含纤维素的纤维、纱线、机织或非机织织物，处本文档来自技高网...

【技术保护点】
分离的甘露聚糖酶，其是　　　　ａ）可以由克隆到大肠杆菌ＤＳＭ１２１９７内存在的质粒中的ＤＮＡ序列的甘露聚糖酶编码部分编码的多肽，或　　　　ｂ）包含ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ：２的第３１－３３０位所示氨基酸序列的多肽，或　　　　ｃ）可以由ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ：１的第９１－９９０位或第９１－１４７０位所示ＤＮＡ序列编码的多肽，或　　　　ｄ）与（ａ）或（ｂ）中定义的多肽至少６５％同源的类似物，或者（ａ）、（ｂ）或（ｃ）的片段。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：MS考皮南，M斯楚雷恩，K斯啻诺，LN安德尔森，ME比卓恩威德，
申请(专利权)人：诺沃奇梅兹有限公司，
类型：发明
国别省市：DK[丹麦]