本发明专利技术公开了一种甘蔗中性/碱性转化酶基因及其编码的蛋白质序列，是在对所有植物中性/碱性转化酶基因全长序列进行进化分析的基础上，以同一家族的中性/碱性转化酶基因序列的保守区设计引物，从甘蔗幼嫩叶片提取总RNA，并经反转录，用常规PCR法扩增，结合RACE技术克隆到中性/碱性转化酶基因的全长cDNA序列，经VectorNTI软件分析，得到序列的ORF为1812bp，编码603个氨基酸。本发明专利技术不仅为研究中性/碱性转化酶的转录和表达机制，进一步探讨蔗糖的积累机理奠定基础，而且通过氨基酸序列可以获得具有生物活性的纯化蛋白，为研究中性/碱性转化酶的生物学功能提供基础。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物工程
，涉及一种甘蔗中性/碱性转化酶基因及其编码的蛋白质序列。
技术介绍
高等植物组织中存在着多种转化酶的同工酶形式。根据最适pH可以分为两大类酸性转化酶和中性/碱性转化酶。中性/碱性转化酶(Alkaline/Neutral Invertase)是一种胞质酶，最适PH值在7. 0-8. O左右。该酶只以蔗糖为底物，能不可逆的把蔗糖分解为葡萄糖和果糖，用于能量代谢。在酸性转化酶和蔗糖合酶活性较低的植物组织中，中性/碱性转化酶能分解蔗糖，为三羧酸循环提供底物，因此它也被视为“维持酶”。目前，已经在小麦、玉米、水稻、木薯、小果等植物中克隆得到该类酶的基因。由于其特殊的PH活性条件，酶活性极不稳定，在提取过程中容易丧失活力，导致纯化该类酶难度很大。己经纯化出来的中性或碱性转化酶主要以两种形式存在八聚体和四聚体。中性或碱性转化酶N-端无信号肽、无糖基化，C-端富含半胱氨酸，且与酸性转化酶的同源性很低。研究发现重金属离子对中性/碱性转化酶没有抑制作用，而对酸性转化酶有抑制作用。因此，认为中性/碱性转化酶与酸性转化酶之间催化位点有明显差异。研究发现，在胡萝卜不同发育期的各种组织都能检测到中性/碱性转化酶基因的 表达，快速生长组织的表达量最高，表明中性/碱性转化酶可能与植物生长相关。乔永旭等认为甜瓜果实在成熟期之前，果实中转化酶活性逐渐降低。但是，只有当中性转化酶活性降低到一定程度之后，蔗糖才开始积累。刘永忠等认为柠檬细胞中的中性转化酶活性，随着果实成熟而下降，在成熟时保持极低水平，说明在果实成熟前，柠檬细胞中糖分的利用与中性转化酶活性有极大的关系。Qiet等(2007)运用图位克隆法在拟南芥突变体中克隆到I个中性/碱性转化酶基因，其在植物生长发育过程中发挥着多种作用，参与渗透胁迫诱导的抑制侧根的发育，抑制作用是通过控制细胞内己糖浓度实现的。Jia等研究发现，水稻短根突变体Oscyt-invl的蔗糖含量增加时，己糖含量降低；外施葡萄糖能够恢复短根突变体Oscyt-invl根的生长,表明OsCyt_invl对水稻根系细胞发育和生殖发育有着重要的作用。目前，对酸性转化酶的研究较多，而中性/碱性转化酶研究较少，仅在少数几种植物中克隆到中性/碱性转化酶基因全长序列，但到目前为止，还没有人在甘蔗上克隆到该基因。
技术实现思路
本专利技术的目的为研究甘蔗中性/碱性转化酶基因的功能，应用甘蔗中性/碱性转化酶基因进行作物遗传改良，提供一种甘蔗中性/碱性转化酶基因及其编码蛋白序列。本专利技术所采取的技术方案如下甘蔗中性/碱性转化酶基因及其编码蛋白序列，是在对所有植物中性/碱性转化酶基因全长序列进行进化分析的基础上，比对同一家族的中性/碱性转化酶基因cDNA序列，并设计扩增中性/碱性转化酶基因核心片段的引物，从甘蔗幼嫩叶片提取总RNA，并经反转录，用RT-PCR法扩增中性/碱性转化酶基因核心片段；在核心片段序列5'端设计三个特异引物，在核心片段序列3'端设计两个特异引物，通过RACE PCR技术分别扩增到中性/碱性转化酶基因核心区的5'端和3'端序列，三个序列经过拼接，获得甘蔗中性/碱性转化酶基因全长cDNA序列，总长2289bp，经VectorNTI软件分析，该基因的ORF为1812bp，编码603个氨基酸，起始密码子(ATG)位于287bp处，终止密码子(TAG)在2098bp之后还有一段191bp的带有真核生物典型的polyA尾巴的非编码序列。本专利技术所获得的甘蔗中性/碱性转化酶基因核心区序列，是用以下核苷酸序列为引物扩增获得权利要求1.甘蔗中性/碱性转化酶基因及其编码的蛋白质序列，其特征在于具有序列表中SEQIDNO. I所示的DNA序列，且它的编码区从第287位核苷酸到2098位核苷酸，编码603个氨基酸残基组成的多肽。2.根据权利要求I所述的甘蔗中性/碱性转化酶基因及其编码的蛋白质序列，其特征在于所述的蛋白具有序列表中SEQID NO. 2所不的氣基酸残基序列的蛋白质,或者是将SEQID NO. 2所示的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQID NO. 2所示的氨基酸残基序列相同活性的衍生蛋白质。3.根据权利要求I所述的甘蔗中性/碱性转化酶基因及其编码的蛋白质序列，其特征在于所述的甘蔗中性/碱性转化酶基因的全长cDNA序列，是用以下核苷酸序列为引物扩增获得 a、用于扩增甘蔗中性/碱性转化酶基因核心区引物对 NIZJF2:(5' -gatcaggtgtttattcgggact-31 ); NIZJR2:(5' -gtcgtagtactccggccatttgtc-3'); b、用于扩增甘蔗中性/碱性转化酶基因3'端的引物对NIXYFl (51 -gcactcttctattcagccctcttg-31 )；NIXYF3 (5' -ccctaaaaacacgccttggtcg-3')； C、扩增甘蔗中性/碱性转化酶基因5'端的引物 NISYFl :(5' -cctcatcaccatcaagcggaat-3')； NISYF2 (5/ -GGCAGTCCATTGTCTTCTCCC-3')；NISYF3 (5' -gaagtcccgaataaacacctgatc-3')。全文摘要本专利技术公开了一种甘蔗中性/碱性转化酶基因及其编码的蛋白质序列，是在对所有植物中性/碱性转化酶基因全长序列进行进化分析的基础上，以同一家族的中性/碱性转化酶基因序列的保守区设计引物，从甘蔗幼嫩叶片提取总RNA，并经反转录，用常规PCR法扩增，结合RACE技术克隆到中性/碱性转化酶基因的全长cDNA序列，经VectorNTI软件分析，得到序列的ORF为1812bp，编码603个氨基酸。本专利技术不仅为研究中性/碱性转化酶的转录和表达机制，进一步探讨蔗糖的积累机理奠定基础，而且通过氨基酸序列可以获得具有生物活性的纯化蛋白，为研究中性/碱性转化酶的生物学功能提供基础。文档编号C12N15/52GK102888414SQ20121033830公开日2013年1月23日 申请日期2012年9月13日 优先权日2012年9月13日专利技术者王爱勤, 牛俊奇, 何龙飞, 杨丽涛, 李杨瑞 申请人:广西大学本文档来自技高网...
【技术保护点】
甘蔗中性/碱性转化酶基因及其编码的蛋白质序列，其特征在于：具有序列表中SEQIDNO.1所示的DNA序列，且它的编码区从第287位核苷酸到2098位核苷酸，编码603个氨基酸残基组成的多肽。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王爱勤，牛俊奇，何龙飞，杨丽涛，李杨瑞，
申请(专利权)人：广西大学，
类型：发明
国别省市：
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