本发明专利技术提供丙型肝炎病毒基因、来自该基因的复制子RNA、导入了复制子RNA的复制子复制细胞、以及使用了该复制子复制细胞的药物的筛选方法。通过将含有下述(A)、(B)、(C)、(D)或(E)的多核苷酸的复制子RNA、或含有编码丙型肝炎病毒的多蛋白氨基酸序列中第1804位的亮氨酸和第1966位的赖氨酸的核苷酸以及编码NS4B蛋白的多核苷酸的基因型1b的复制子RNA导入细胞中，可以制作复制子复制细胞，利用该复制子复制细胞可以进行药物的筛选。所述(A)～(E)的多核苷酸为：(A)包含SEQ?ID?NO：5所示的核苷酸序列的多核苷酸；(B)包含SEQ?ID?NO：7所示的核苷酸序列的多核苷酸；(C)编码包含SEQ?ID?NO：6所示的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；(D)编码包含SEQ?ID?NO：8所示的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；(E)包含与SEQ?ID?NO：5或SEQ?ID?NO：7所示的核苷酸序列的同源性为90％以上的核苷酸序列的多核苷酸。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及丙型肝炎病毒(以下有时称作“HCV”)基因、来自该基因的复制子RNA、导入了复制子RNA的复制子复制细胞、以及使用了该复制子复制细胞的药物的筛选方法。
技术介绍
HCV是丙型慢性肝炎的致病因子，根据WHO的统计，推测全球有I. 7亿感染者。HCV是分类为黄病毒科、黄病毒属的病毒，认为其经由血液或血液成分而感染，在肝脏中增殖。虽然HCV感染者在感染初期仅出现较轻微的症状，但往往会转为慢性，经过一定期间的无症候性期后，发展为慢性肝炎。而且，随着长期感染，病情向肝硬化发展，往往会发展为肝癌。认为肝癌中有95%与肝炎病毒有关,而其中的80%是由HCV感染引起的。在丙型慢性肝炎的治疗中广泛使用干扰素。近年来，通过改良干扰素的剂型、以及改善干扰素与利巴韦林联用疗法等给药方法，HCV从体内被驱除、治愈的比例也逐渐增加。但通过给予干扰素而得到的治愈率才50%左右，认为存在多种对干扰素治疗显示出抵抗性的HCV。因此，人们希望开发对干扰素抵抗性病毒具有治疗效果的药物。在上述药物的开发中，药物的筛选系统是必需的。虽然有人报道了使HCV在试管内感染来自人或猴的细胞并使其增殖，但上述增殖系统的感染效率、增殖效率均低，无法用作药物的筛选系统。最近，脇田等人从丙型重症肝炎患者体内分离出基因型2a的HCV基因(专利文献I)。在试管内(体外)由上述分离的JFHl株合成全长RNA，并导入来自人肝癌的细胞(Huh7细胞)中时，可以得到在细胞内自主复制的复制子RNA。并且，确认感染性微粒被排放到导入有复制子RNA的细胞的培养上清中(非专利文献I)。因此，通过将JFHl株的复制子RNA导入来自人肝癌的细胞(Huh7细胞)中，并将得到的感染性微粒再次与来自人肝癌的细胞进行培养，可以建立再感染增殖系统。通过使用该再感染增殖系统，开始了抗HCV药物的筛选。但是，JFHl株为基因型2a的HCV，是干扰素感受性的HCV。因此，不具有对干扰素显示出抵抗性的HCV基因区，也无法特定在规定干扰素抵抗性的区域发挥作用的宿主侧的因子。因此，有可能无法筛选对干扰素抵抗性的HCV有效的药物。最近，Lemon等人报道了将基因型Ia的H77株的复制子RNA导入来自人肝癌的细胞(Huh7细胞)中的感染增殖系统(非专利文献2)。但是，虽然使由导入了该复制子RNA的细胞的培养上清得到的病毒颗粒再次感染来自人肝癌的细胞，但与上述JFHl株的感染性颗粒相比，感染效价低约400倍，由此认为H77株的复制子RNA释放了失去感染性的病毒颗粒。因此认为可在试管内复制的H77株的RNA复制子失去了产生感染性颗粒的功能，并未保持本来的HCV的增殖功能。因此，使用了该H77的复制子RNA的感染增殖系统的筛选系统有可能无法筛选对在机体内具有增殖功能的HCV有效的药物。如上所述，由于HCV不存在高效率的试管内培养系统，所以难以进行对HCV治疗有用的药物的筛选。例如，对于目前广泛用于HCV治疗的干扰素，是以患者为受试体开发和改良了直接疗法，对患者造成很大的负担。上述脇田和Lemon所报道的复制子RNA虽然可以筛选一部分药物，但这些复制子RNA存在上述问题，认为其无法筛选可广泛用于HCV治疗的药物。 专利文献I :日本特开2002-171978号公报非专利文献I =Nature Medicine,(美国)2005年，第11卷，第791 796页非专利文献2 !Proceeding of the National Academy of Science of theUnited State of America, 2006 年，第 103 卷，第 2310 2315 页
技术实现思路
专利技术所要解决的课题本专利技术人等为了得到可广泛用于HCV治疗的药物，对HCV的高效率增殖系统、特别是对具有基因型Ib型的基因、呈干扰素抵抗性、可产生感染性颗粒的试管内增殖系统进行了深入研究。首先，从重症化肝炎患者的血清中分离出全长HCV基因，确定了具有9594碱基的核苷酸序列的SEQ ID NO :1的全核苷酸序列。由该HCV基因制作复制子RNA，并将其导入来自人肝癌的细胞中时，确认该复制子RNA在细胞内自主增殖，可以进行RNA的复制。进一步发现通过向该复制子RNA的NS4B蛋白区导入2个氨基酸序列的突变，RNA的复制效率显著提高，许多病毒颗粒被释放到培养上清中。之后，通过将该HCV颗粒再次与来自人肝癌的细胞进行培养，可以建立再感染增殖系统。进一步发现使用了该复制子复制细胞和感染性颗粒的再感染增殖系统作为HCV治疗用药物的筛选系统、特别是作为对干扰素抵抗性病毒的药物的筛选系统是有用的。本专利技术基于上述知识而完成。解决课题的方法因此，本专利技术涉及丙型肝炎病毒基因，该基因含有选自下述(A) (F)的多核苷酸(A)包含SEQ ID NO :5所不的核苷酸序列的多核苷酸；(B)包含SEQ ID NO 7所示的核苷酸序列的多核苷酸；(C)包含SEQ ID NO :65所不的核苷酸序列的多核苷酸；(D)编码包含SEQ ID NO 6所示的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；(E)编码包含SEQ ID NO 8所示的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；以及(F)编码包含SEQ ID NO 66所示的氨基酸序列的多肽的多核苷酸。在本专利技术的丙型肝炎病毒基因的优选方式中，所述丙型肝炎病毒基因为包含SEQID NO USEQ ID NO :3、SEQ ID NO :10、SEQ ID N0:61 或 SEQ ID NO :63 所示的核苷酸序列的多核苷酸。另外，本专利技术涉及基因型Ib的丙型肝炎病毒基因，该基因含有编码丙型肝炎病毒的多蛋白的氨基酸序列中第1804位的亮氨酸和第1966位的赖氨酸的核苷酸和编码NS4B蛋白的多核苷酸。本专利技术还涉及DNA，该DNA包括在包含上述丙型肝炎病毒基因的核苷酸序列中尿苷置换成胸腺嘧啶的核苷酸序列的单链DNA。本专利技术还涉及多肽，该多肽包含SEQ ID NO :6、SEQ ID NO 8或SEQ ID NO 66所示的氨基酸序列。并且，本专利技术还涉及丙型肝炎病毒多蛋白，其中NS4B区的肽为包含SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :8或SEQ ID NO :66所示的氨基酸序列的多肽。本专利技术还涉及丙型肝炎病毒蛋白，该蛋白为选自包含SEQ ID N0:2、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO : 11、SEQ ID NO 62或SEQ ID NO 64所示的氨基酸序列中第I位 第191位氨基酸序列的核心蛋白、包含第192位 第383位氨基酸序列的El蛋白、包含第384位 第 746位氨基酸序列的E2蛋白、包含第747位 第809位氨基酸序列的P7蛋白、包含第810位 第1026位氨基酸序列的NS2蛋白、包含第1027位 第1657位氨基酸序列的NS3蛋白、包含第1658位 第1711位氨基酸序列的NS4A蛋白、包含第1712位 第1972位氨基酸序列的NS4B蛋白、包含第1973位 第2419位氨基酸序列的NS5A蛋白、包含第2420位 第3010位氨基酸序列的NS5B蛋白中的至少一种。本专利技术还涉及复制子RNA，该复制子RNA包括选自下述(A) (G)的多核苷酸(A)包含SEQ ID NO :5所不的核苷酸本文档来自技高网...
【技术保护点】
丙型肝炎病毒基因，该基因包括选自下述的多核苷酸：(B)由SEQ？ID？NO：7所示的核苷酸序列组成的多核苷酸；(C)由SEQ？ID？NO：65所示的核苷酸序列组成的多核苷酸；(E)编码由SEQ？ID？NO：8所示的氨基酸序列组成的多肽的多核苷酸；以及(F)编码由SEQ？ID？NO：66所示的氨基酸序列组成的多肽的多核苷酸。
【技术特征摘要】
...
【专利技术属性】
技术研发人员：森健一，槙升，深井浩未，大植千春，
申请(专利权)人：株式会社先端生命科学研究所，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。