用于测定含病毒样品的方法、病毒测定方法和诊断试剂盒技术

一种用于处理含病毒样品的方法，其特征在于以处理溶液处理含病毒样品，该处理溶液包含（１）阴离子型表面活性剂和（２）两性表面活性剂、非离子型表面活性剂或者蛋白质变性剂；一种利用所说处理方法的病毒测定方法；一种用于处理含病毒样品的方法，其特征在于用处理溶液处理溶液含病毒样品，该处理溶液包含（１）离液序列高的离于和（２）酸化剂；一种利用所说处理方法的病毒测定方法；一种病毒测定方法，其特征在于：在具有十个或更多个碳原子的烷基以及仲铵，叔胺或季胺的表面活性剂或者非离子型表面活性剂或者两者均存在时，基于它们各自与其探针的结合，测定病毒抗原和病毒抗体；用于实施上述方法的一种单克隆抗体和一种产生该抗体的杂交瘤。（*该技术在2018年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及检测或者测定病毒的方法及所用的试剂。
技术介绍
当前，已经利用各种病毒检测方法来检测传染性病毒在血液或者血制品中的存在，并用来确定病毒在患病患者中的存在。然而，尽管敏感性和特异性随所要检测的病毒类型而变化，但这些方法并非总是高度敏感或者特异性的。即使当它们具有足够的敏感性和特异性时，它们也经常是昂贵的，并且如在病毒的培养与分离中需要冗长的过程。作为本专利技术的背景，C型肝炎(丙型肝炎)将在下面得到详尽的陈述。丙型肝炎病毒的病原体长期是未知的，但是，当病毒基因得到克隆(科学，244359-362，1989)，以及经由利用基于所说的基因产生的重组抗原的抗体测定的诊断方法得到发展(科学，244362-364，1989；日本专利出版物(Kohyo)，2(1990)-500880)时，人们发现丙型肝炎是病原体为丙型肝炎病毒(HCV)的传染病，该病毒通过血液和血制品作为其主要传染途径传播。随着所谓的第二代抗体检验方法(其中的重组核心抗原和重组NS3抗原已得到增加)的产生，现在已有可能通过检验他们的血清来事实上确定所有HCV的患者。这已使得在日本根除几乎所有通过献血传播的HCV感染成为可能。然而，至于其它普通的病毒感染，如通过人免疫缺损病毒(HIV)的病毒感染，在感染之后有一定的时间长度直到抗体出现，或者所谓的窗口时期，其中病毒不可由现有的检验方法所检测。这意味着，在卖血是合法的区域或者在日本的一些地区，第二次感染的风险仍然存在，因为血液传播的组分不能为抗体检验方法所确定。抗体检验方法也有弊端，即它不能区别已从感染恢复的人和处于感染活动阶段的人，这是由于其检验原理所致。当前，干扰素(IFN)用于丙型肝炎的治疗。然而，一些研究者强调，通过仅仅测量HCV的抗体滴度就可以评价治疗效果，因为在HCV为IFN消除之后第6个月滴度降低。然而，由于仅仅在抗原刺激降低之后或者在抗原消除之后的几个月，抗体滴度才开始降低，因此不可能在所需的时间与以所需的准确度，单独地由抗体检验方法确定IFN的施用是否导致HCV的消除。因此，微为了监测治疗，除检测HCV抗体外还需要检测HCV本身。困难的是建立直接检测HCV病毒微粒(病毒抗原)的方法，因为与其它病毒如肝炎B病毒(HBV)相比，该病毒的血液水平非常低，还因为该病毒不能体外传播或者利用动物等作为宿主。因此，代之以检测病毒抗原，检测病毒基因组RNA的方法得到发展，如聚合酶链式反应(PCR)方法(科学，2301350-1354，1985)以及支链DNA探针方法。但是，与检测病毒抗原的方法相比，检测病毒基因组的方法存在几个问题。首先，有人已指出，由于所要检测的物质是在存储期间极不稳定的RNA，血清的冻结和解冻过程可以造成测量值的降低。因此，所要检验的血清样品必须比当它们用于其它测定方法时更小心地得到存储。在样品的运输过程中也必须给以最大限度的小心。虽然包含利用PCR方法的检验方法对检测基因片段是最敏感的，但是它们存在一定的问题，即从基因组RNA到模板DNA的逆转录经常伴随着损失，因此这要求好的技巧以便获得精确的定量值，并且由于扩增是该方法的重要原理，在污染的情况下可能产生高发生率的假阳性，因此同时进行大量样品的处理是不可能的。再者，即使这些方法(假定其为简单方法)利用2个或2个多小时来预处理样品，但是将由于需要离心等等的重复过程而变得复杂化。此外，如此复杂的过程污染的可能性增加，并由此获得假阳性的结果。另一方面，支链DNA探针方法在检测敏感性方面是低的，此外在获得检验结果之前要花费大约20小时(Igaku toYakugaku31961-970，1994)，因而该方法在敏感性和处理时间方面有待作许多所需的改进。为了解决上述与病毒基因组检测方法有关的问题，人们发展了包括直接检测病毒抗原在内的方法。正如日本未审专利出版物(Kokai)第8号(1996)-29427所显示的，人们发展了这样一种方法，即利用核心抗原特异性的单克隆抗体检测血清中的HCV的核心抗原。正如有关文献(Tanaka等，肝脏病学杂志23742-745，1995；Fujino等，Igaku to Yakugaku361065-1070，1996)所报道的，检测血清中的核心抗原的方法如同上述的检测病毒基因组的方法一样，已经显示出有临床用途。然而，如同检测病毒基因组的方法一样，检测血清中的核心抗原的方法仍然存在几个需要解决的主要问题。这样的问题之一即，与PCR方法相比，检测病毒基因组的方法的敏感性低，以致它不能用作为血清筛选的最后检验方法。Tanaka等(Journalof Hepatology，23742-745，1995)指出其检测限制为104-105拷贝/ml的HCV RNA。Fujino等(Igaku to Yakugaku361065-1070，1996)报道，对102例已由最敏感的CRT(竞争性逆转录)-PCR检测方法检测出为RNA阳性的、接受慢性丙型肝炎治疗之前的患者血清的检测显示，该方法的阳性率为67％。也就是说，就敏感性来说，该方法远落后于最敏感的CRT-PCR方法。其次，当该方法用于筛选时，处理测量样品的复杂过程以及所需的长时间使问题出现。因此，该方法需要多步样品(血清)处理过程，这些过程包括浓缩病毒微粒和除去血清组分的聚乙烯乙二醇处理(4℃，1小时)；离心(15分钟)；除去上清液；尿素处理；碱处理(37℃，30分钟)；加入中和剂等等。此外，利用尿素的分散方法，由于PEG处理而使粘度有所增加的沉淀要求极大的技巧。因此，为了获得再现性结果，要求极大的技巧，此外，最小为2小时的处理是必需的。此外，诸如离心、上清液除去等方法不适于自动化处理，并且很难同时进行大量样品的处理。因此，从处理的难易性方面来看，该方法也不适于需要处理大量样品的应用(如在筛选检验中)。另一方面，在下列几点上，病毒抗原检测系统优于高度敏感的PCR方法。由此，它极为耐受污染，因为它在检测步骤中不包括任何额外扩增过程。此外，因为意在检测相对稳定的抗原蛋白质而不是很不稳定的RNA，所以样品存储过程中不需要给以任何额外关照，它不需要诸如PCR检测样品所需的深度冷藏箱之类的特殊设备，并且样品的运输也更容易。这些特性使该方法适于应用于其中需要进行大量样品测定的检测中，如在血液工业或者健康检查检验中。然而，正如以上所指出的，由于检测核心抗原的公开方法不适于自动化，并且其敏感性低，以致它不能在要求高敏感性的应用(如在血液工业中)中作为金标准(goldstandard)，因此，它不能运用于处理大量样品(如筛选)的检验，并且不能最好地利用其优于PCR方法的有利特性。此外，临床上有用的测定方法常常必须面对敏感性、特异性、再现性、易于处理以及低成本的挑战，并且需要不断努力以尽可能地满足这些挑战。就不同于HCV的病毒抗原的检测而论，尤其是用于处理大量样品的筛选中的病毒抗原检测，有许多由于它们的低敏感性(与PCR方法相比)或者所需抗原未能充分暴露而未投入实际应用的方法。专利技术的说明本专利技术的目的是提供用于检测各种病毒抗原的方法，包括用于检测HCV抗原的方法，该方法适于处理大量样品，如在血液工业与健康检查中的筛选。换句话说，本专利技术的目的是提供用于检测各种病毒抗原的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于处理包含病毒的样品的方法，其特征在于以处理溶液处理包含病毒的样品，该处理溶液包含（１）阴离子型表面活性剂和（２）两性表面活性剂、非离子型表面活性剂或者蛋白质变性剂。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：青柳克己，大植千春，饭田久美子，村木达治，八木慎太郎，
申请(专利权)人：株式会社先端生命科学研究所，
类型：发明
国别省市：JP[日本]