本发明专利技术涉及新的分离的ＤＮＡ序列，其包含全部或部分编码萨菲菌素合酶的基因簇、参与非核糖体肽／聚酮化合物混合化合物的生物合成的加工及调控基因，或具有改变的生物合成能力的突变体，由该ＤＮＡ或突变体编码的多肽或其突变体，含有该ＤＮＡ或其突变体的载体，由该ＤＮＡ、其突变体或载体转化的宿主细胞，以及产生萨菲菌素化合物的方法。本发明专利技术还提供了具有亲环蛋白抑制活性的化合物，其用作免疫抑制剂、抗病毒剂或心脏保护剂。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及微生物遗传资源和基因工程领域，并且尤其涉及免疫抑制剂萨菲菌素 A及相关类似物的生物合成基因簇的克隆、序列分析、体内功能验证及其应用。
技术介绍
免疫抑制剂萨菲菌素A(SFA)是由链霉菌A92-308110 (Sti^ptomyces sp. A92-308110，也称为淡黄链霉菌(Sti^ptomyces flaveolus)或链霉菌DSM9954)产生的聚酮化合物-肽混合天然产物(Sanglier等，1999 ；Fehr等，1999 ；WO 97/02285)。至今已经公开了 20多种萨菲菌素结构类似物的分离，SFA在这些类似物中具有最高的免疫抑制活性之一(Kallen等，2005 ;Sanglier等，1999)。从结构上来看SFA中22元大环内酯骨架由聚酮化合物碳链和三肽链组成。该肽链包含一个天然氨基酸缬氨酸，以及两个非天然氨基酸⑶-m-酪氨酸和(S)-六氢哒嗪-3-羧酸((幻-piperazic acid)，它们以酰氨键连接， 并且六氢哒嗪-3-羧酸1位氮原子参与酰氨键的形成，这是在迄今分离的所有含有六氢哒嗪-3-羧酸结构的天然产物中唯一一例。此外，一个螺环单元通过一条聚酮化合物长链和大环内酯相连，形成提篮式结构。螺环部分含有九个手性中心(SFA总共具有17个)，中间含有一个季碳中心，这在目前描述的天然产物中是独特的。已从链霉菌Α92-308110(淡黄链霉菌)的发酵肉汤中直接分离了一系列类似物，包括萨菲菌素B、C、D、E、F、G、H、I、J、 K 和 L(Fehr 等，1999，Sanglier 等，1999，W098/07743)。特别地，已显示萨菲菌素 B(SFB) 在MLR测试法中具有比SFA更高的免疫抑制活性(Sanglier等，1999)。尽管经过大量的努力实现了 SFA及其大环类似物的总合成Gedrani等2003 ；Nicolau等，1999 ；I^aquette等， 2002 ；Metternich等，1999)，但是没有对其生物合成途径进行具体的体内和体外研究。SFA具有强的免疫抑制活性(Powell和Zheng，2006)，抑制HIV和HCV感染(Zander 等，2003 ；Sokolskaja等，2004 ；Watashi等，2005)，以及阻止由于线粒体膜通透性转运孔 (MPTP)病理性开放导致的严重的心脏细胞死亡(Clarke等，2002)。与目前临床使用的免疫抑制剂，诸如环孢菌素(CsA) JK506和雷帕霉素(rapamycin)相比，SFA有相似的作用机制，但是又具有不同的效应靶点(H^rtel等，2006，Zhang&Liu.，2001 ；Zenke等，2001)。CsA 作用于亲环蛋白A(CypA) (Handschumacher等，1984)，FK506和雷帕霉素与HiBP结合形成复合物Gchreiber，1991)；而CsA-CypA复合物及H(506-FKBP复合物与相同的目标蛋白钙依赖磷酸酶(calcineurin)相互作用，由此抑制钙依赖磷酸酶的丝氨酸/苏氨酸磷酸酶活性，并且阻断细胞因子产生，尤其是阻断了白细胞介素2 (IL-2)的转录，其最终导致T细胞阻滞在(VG1期(Liu等，1991)。Rap-FKBP复合物与蛋白激酶FRAP (也称为RAFT或mTOR) 相互作用(Brown等，1994)，并且阻止了 T细胞上IL-2受体的磷酸化，使T细胞生长被阻断在Gl-S期。而已显示SFA与亲环蛋白诸如亲环蛋白A和B结合，并且抑制它们的异构酶活性(Zenke等，2001)，目前SFA-CypA复合物的效应蛋白仍然未知。由于现在仍未能发现SFA-CypA复合物的效应蛋白，所以提示SFA的免疫抑制活性并不是通过SFA-CypA复合物直接介导的。近3年来，众多的科学小组研究发现，SFA可以竞争性阻止NF- κ B与P53基因上游的转录位点结合从而活化P53，进而抑制信号通路下游的Cyclin E-cdk2的磷酸化，由此抑制应答IL-2引起的Rb高磷酸化，使得细胞对IL-2不敏感，其使得细胞停留在Gl-S期ahang&LiudOOl)。其次，SFA以一种未知的机制在不影响人类树突细胞生长的情况下抑制了 IL-12p7°的产生(Meinschulte等，200；3)。IL_12p7° 在调控Thl和NK细胞增殖方面起着关键的作用，是连接先天性免疫和获得性免疫的桥梁。 此外，由于现有可商购的免疫抑制药物会产生严重的肾毒性和中枢神经系统毒性副作用 (Paquette等，200 ，因此阻碍了它们在一些免疫失调疾病方面的应用(例如，钙依赖磷酸酶(calcineurin)同时是CsA和Π(506的免疫抑制活性和毒性的根本原因)。为了开发可替代的免疫抑制剂或免疫修饰剂，其他组已经将SFA作为新一代低毒的高效免疫抑制剂进行了一些开发(W097/02285)。利用X射线衍射对SFA大环片段和CypA之间结构-活性关系研究表明三肽结构嵌入在CypA的沟内并且对结合至关重要，而分别位于17位和14位上的侧链羟基和羰基对于结合不太重要；饱和C18-C20位反式二烯的缺失使结合常数降低7倍，提示反式二烯对构象有稳定作用Gedrani等，200 。计算机建模研究显示SFA螺环单元也对稳定SFA-CypA 的结合有贡献(Pemberton等，2003)。完整的SFA-CypA复合物的晶体结构显示SFA-CypA和 CsA-CypA的结合区域基本相同，并且SFA和CsA都主要和W121、R55、H126、N102和Q63残基相互作用；大环和螺环部分之间的C24-C32链和CypA的I57、T119和W121残基有范德华作用，另外与CypA的晶体结构相比，SFA聚酮化合物长链的存在改变了 W121侧链取向；螺环单元中，只有甲基C45和CypA的157和F60的侧链原子有范德华作用(Kallen等，2005)。SFA-CypA复合物可以以二聚体形式稳定存在，如通过凝胶过滤色谱所证实的那样。根据晶体分析发现，除了螺二环和α-酮基丁酸酯部分之外，SFA所有的剩余部分都深深的埋入二聚体中；Ε，Ε- 二烯区域C18-C22虽然不参与和CypA的直接接触，但却和二聚体中相邻SFA的间位酪氨酸有范德华作用，其有利于复合物中二聚体的缔合；两个SFA分子在C18-C22中彼此间有范德华力作用；并且，二聚体复合物中一个CypA分子的W121和另一 CypA分子的R148有直接氢键连接。应用已知产生SFA的链霉菌，即链霉菌Α92_308110(淡黄链霉菌)，本专利技术人克隆了其生物合成基因簇，并采用微生物学、分子生物学、生物化学及有机化学相结合的方法进一步研究SFA的生物合成。通过对生物合成的研究，揭示了产生诸如六氢哒嗪-3-羧酸的独特化学结构的酶学机理。在此基础上，对SFA的生物合成途径进行了遗传修饰，并产生了新的化合物。由于本专利技术能够商业应用重组DNA技术和生物合成工程，以提高萨菲菌素的产量和新萨菲菌素类似物的产生，因此本专利技术尤其有用。专利技术概述本专利技术有利地提供了参与产生生物合成基因产物、尤其是萨菲菌素生物合成的新 DNA序列和蛋白质。该基因和蛋白的特定实施方案在所附本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．分离的核酸分子，其包含：（ａ）包含ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１的萨菲菌素Ａ生物合成基因簇核酸；（ｂ）核酸，其与（ａ）的核酸具有至少８０％序列同一性并且其编码的多肽和由（ａ）的核酸编码的那些多肽具有用于制备聚酮化合物或聚酮化合物起始单元的相同的酶活性和调控活性；（ｃ）核酸，其编码与由（ａ）的核酸编码的一种或多种多肽具有至少８０％氨基酸序列同一性的一种或多种多肽，并且其编码的一种或多种多肽具有制备聚酮化合物或聚酮化合物起始单元或前体所需的一种或多种酶活性或调控活性；（ｄ）（ａ）、（ｂ）或（ｃ）的核酸部分，其编码聚酮化合物合酶或非核糖体肽合酶多肽；或者任一聚酮化合物合酶或非核糖体肽合酶多肽、或聚酮化合物起始单元或前体生物合成基因产物或聚酮化合物生物合成调控多肽的酶活性模块；或（ｅ）（ｄ）的核酸部分，其编码聚酮化合物合酶或非核糖体肽合酶多肽的酶活性结构域；或者任一聚酮化合物合酶或非核糖体肽合酶多肽、或聚酮化合物起始单元或前体生物合成基因产物或聚酮化合物生物合成调控多肽的的酶活性模块的酶活性结构域。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘文，
申请(专利权)人：中国科学院上海有机化学研究所，
类型：发明
国别省市：31
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