腈水合酶突变体制造技术

本发明专利技术的腈水合酶突变体包含至少１个氨基酸取代为其他氨基酸的取代，通过１个氨基酸取代而改善腈水合酶的２个以上的性质。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种腈水合酶突变体、编码该腈水合酶突变体的基因、含有该基因的 DNA、含有该基因的质粒、由该质粒形成的转化体以及使用该转化体生产腈水合酶突变体的方法。
技术介绍
近年来，已经发现了作为具有腈水合活性的酶的腈水合酶，该酶能够通过水合作用将各种化合物的腈基转变成酰胺基，并且公开了多种生产该酶的微生物株。为了在工业上使用腈水合酶从腈化合物制造酰胺化合物，降低酰胺化合物的制造成本中所占的该酶的制造成本是重要的。更具体而言，必须提高酶制备物的每单位重量的活性值。作为通过增加酶制备物中的酶量提高活性值的方法，已尝试对编码该酶的基因进行克隆，利用基因工程方法使该酶大量表达。例如，已制备出可使来源于嗜热假诺卡氏菌(Pseudonocardia thermophila)的腈水合酶在转化体内大量表达的质粒及通过该质粒进行转化而得到的细胞株。此外，可以利用该细胞株来生产该腈水合酶，以及可以通过将该细胞株或由该细胞株得到的该腈水合酶与腈化合物接触来制造对应的酰胺化合物(参见专利文献1)。另一方面，如果能实现酶分子自身的高活化，则可以进一步提高酶制备物的活性值。到目前为止，正尝试探索下述腈水合酶突变体，该突变体通过在不破坏其活性的情况下对腈水合酶的氨基酸序列中的特定氨基酸残基导入突变，而使基质特异性、酶稳定性等得到改良(参见专利文献2 4)。需要说明的是，作为来源于紫红红球菌的腈水合酶突变体，有专利文献5、6中所记载的腈水合酶突变体。专利文献1 日本特开平9-275978号公报专利文献2 日本特开2004-194588号公报专利文献3 日本特开2005-160403号公报专利文献4 国际公开第2004/056990号说明书专利文献5 日本特开2007-143409号公报专利文献6 日本特开2008-253182号公报
技术实现思路
但是，与专利文献1中记载的野生型腈水合酶相比、其反应初速度及酶稳定性同时提高的具体突变体尚属未知。期待可以通过使反应初速度及酶稳定性同时提高来削减酰胺化合物的制造成本。本专利技术的目的在于提供一种具有高的反应初速度及酶稳定性的腈水合酶。S卩，本专利技术如下所述。 一种腈水合酶突变体，其特征在于，包含至少1个氨基酸取代为其他氨基酸的取代，所述取代通过3个以下1个以上氨基酸取代而改善腈水合酶的2个以上的性质。如所述的腈水合酶突变体，其特征在于，所述被改善的性质为反应初速度及热稳定性。如或所述的腈水合酶突变体，其特征在于，含有序列表的序列号1表示的α亚单位和序列表的序列号2表示的β亚单位，并且含有选自由下述(a) (1)组成的氨基酸取代位置中的至少1个氨基酸取代为其他氨基酸的取代(a) α亚单位的第92位；(b) α亚单位的第94位；(c) α亚单位的第197位；(d) β亚单位的第4位；(Θ)β亚单位的第对位；(f) β亚单位的第79位；(g) β亚单位的第96位；(h) β亚单位的第107位；⑴β亚单位的第2 位；(j) β亚单位的第110位及β亚单位的第231位；(k) β亚单位的第206位及β亚单位的第230位；(1) α亚单位的第13位、α亚单位的第27位、及β亚单位的第110位。如所述的腈水合酶突变体，其特征在于，进一步包含选自由下述(m) (u)组成的氨基酸取代位置中的至少1个氨基酸取代为其他氨基酸的取代(m)为(b)或(g)时，α亚单位的第13位；(η)为(b)或(h)时，α亚单位的第27位；(ο) (d)及(f)；(ρ)为(f)时，β亚单位的第230位；(q) (a)及(i)；(r)为(i)时，α亚单位的第13号及β亚单位的第206位；(s)为(a)及(d)时，β亚单位的第206位；(t)为(c)及(h)时，β亚单位的第230位；(u)为(f)时，β亚单位的第230位及β亚单位的第231位。如所述的腈水合酶突变体，其特征在于，为(e)时，进一步包含选自由 (a)、(c)、(f)、⑴、(h)、β亚单位的第230位、及β亚单位的第231位组成的组中的至少 1个氨基酸取代为其他氨基酸的取代。如 中任一项所述的腈水合酶突变体，其特征在于α亚单位的第13位氨基酸被取代时，Ile被取代为Leu ；α亚单位的第27位氨基酸被取代时，Met被取代为Ile ；α亚单位的第92位氨基酸被取代时，Asp被取代为Glu ；α亚单位的第94位氨基酸被取代时，Met被取代为Ile ；α亚单位的第197位氨基酸被取代时，Gly被取代为Cys ；β亚单位的第4位氨基酸被取代时，Val被取代为Met ；β亚单位的第M位氨基酸被取代时，Val被取代为Ile ；β亚单位的第79位氨基酸被取代时，His被取代为Asn ；β亚单位的第96位氨基酸被取代时，Gln被取代为Arg ；β亚单位的第107位氨基酸被取代时，Pro被取代为Met ；β亚单位的第110位氨基酸被取代时，Glu被取代为Asn ；β亚单位的第206位氨基酸被取代时，Pro被取代为Leu ；β亚单位的第2 位氨基酸被取代时，Val被取代为Ile ；β亚单位的第230位氨基酸被取代时，Ala被取代为Glu ；β亚单位的第231位氨基酸被取代时，Ala被取代为Val。如 中任一项所述的腈水合酶突变体，其特征在于，进一步包含选自由下述(aa) (br)组成的氨基酸取代中的至少1个氨基酸取代(aa)将α亚单位的第36位的Thr取代为Met、及将α亚单位的第1 位的Phe 取代为Tyr ；(ab)将α亚单位的第148位的Gly取代为Asp、及将α亚单位的第204位的Val 取代为Arg ；(ac)将β亚单位的第51位的Phe取代为Val、及将β亚单位的第108位的Glu 取代为Asp ；(ad)将β亚单位的第118位的Phe取代为Val、及将β亚单位的第200位的Ala 取代为Glu ；(ae)将β亚单位的第160位的Arg取代为Trp、及将β亚单位的第186位的Leu 取代为Arg ；(af)将α亚单位的第6位的Leu取代为Ilirjf α亚单位的第36位的Thr取代为Met、及将α亚单位的第1 位的Phe取代为Tyr ；(ag)将α亚单位的第19位的Ala取代为Valjf α亚单位的第71位的Arg取代为His、及将α亚单位的第1 位的Phe取代为Tyr ；(ah)将α亚单位的第36位的Thr取代为Met、将α亚单位的第148位的Gly取代为Asp、及将α亚单位的第204位的Val取代为Arg ；(ai)将β亚单位的第10位的Ilir取代为Asp、将β亚单位的第118位的Phe取代为Val、及将β亚单位的第200位的Ala取代为Glu ；(aj)将β亚单位的第37位的Phe取代为Leu、将β亚单位的第108位的Glu取代为Asp、及将β亚单位的第200位的Ala取代为Glu ；(ak)将β亚单位的第37位的Phe取代为Valjf β亚单位的第108位的Glu取代为Asp、及将β亚单位的第200位的Ala取代为Glu ；(al)将β亚单位的第41位的Phe取代为lie、将β亚单位的第51位的Phe取代为Val、及将β亚单位的第108位的Glu取代为Asp ；(am)将β亚单位的第46位的Met取代为Lysjf β亚单位的第108位的Glu取代为Arg、及将本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种腈水合酶突变体，其特征在于，包含至少１个氨基酸取代为其他氨基酸的取代，所述取代通过３个以下１个以上的氨基酸取代而改善腈水合酶的２个以上的性质。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：松本和也，
申请(专利权)人：三井化学株式会社，
类型：发明
国别省市：JP