【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及微生物学和分子生物学领域。更具体地说，提供了ー种使用具有改善的腈水解酶活性的突变的腈水解酶，由こ醇腈酶促生产こ醇酸的方法。
技术介绍
こ醇酸(H0CH2C00H ；CAS登记号为79-14-1)是羧酸的a -羟基酸家族的最简单成员。其特性使之理想地广泛用于消费和エ业用途，包括用于水井修复、皮革エ业、油气エ业、洗衣和纺织エ业、在聚こ醇酸(PGA)制备中作为单体、以及作为个人护理产品成分。在多个行业中，こ醇酸还是的清洁剂的主要成分(乳制品和食品加工设别清洁剂、家用和机构用清洁剂、エ业清洁剂[用于运输设备、砖石建筑、印刷电路板、不锈钢锅炉和加工设备、冷却塔/热交換器]、以及金属加工[用于金属酸洗、铜抛光、蚀刻、电镀、电解抛光])。最近，已报道聚こ醇酸作为阻气性材料(即显示高阻氧特性)用于包装食品及汽水(W02005/106005A1)。然而，こ醇酸的传统化学合成产生了大量的杂质，在用于制备作为阻气性材料的聚こ醇酸之前必须除去。商业化生产こ醇酸的新技术，特别是ー种以高纯度及低成本生产こ醇酸的技术，将是エ业上所渴望获得的。已知多种使用相应的a-羟基腈作为原料以及微生物作为催化剂用于制备a-羟基酸的方法。所产生的a-羟基酸的例子包括こ醇酸、乳酸、2-羟基异丁酸、2-羟基-2-苯丙酸、苦杏仁酸、2-羟基-3，3- ニ甲基-4- 丁内酷和4-甲硫丁酸。这些产物是使用微生物合成的，例如属于诺卡氏菌属(Nocardia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、短杆菌属(Brevibacterium)、金杆菌属(Aureobacterium)、假单胞菌属(Pseud...
【技术保护点】
一种由乙醇腈生产乙醇酸的方法，包括：a)将适合的含水反应混合物中的乙醇腈与包含具有腈水解酶活性的多肽的酶催化剂接触，由此产生乙醇酸，所述多肽如SEQ？ID？NO:？22所示；和b)以盐或酸的形式回收(a)中产生的乙醇酸；其中当在相同的反应条件下将乙醇腈转化为乙醇酸时，相对于敏捷食酸菌72W腈水解酶的腈水解酶活性，所述酶催化剂提供了至少1.5倍腈水解酶活性增加。
【技术特征摘要】
2004.12.22 US 60/638,176中所提及的规定的特征、整体、步骤或组分的存在，但其并不排除ー个或多个其他特征、整体、步骤、组分或它们的组的存在或添加。如本文所使用的，修饰所使用的本发明成分或反应物的数量的术语“约”指数量上的变化，所述变化可例如通过用于在真实世界中制备浓缩物或使用溶液的标准量度和液体处理工序；通过在这些エ序中的疏忽过失；通过用于制造组合物或执行方法的产品、原料或配料纯度的差异等产生。术语“约”还包含由于由特定的初始混合物产生的组合物的不 同的平衡条件之故所相异的量。无论是否为术语“约”所修饰，权利要求包括相等的量。在一个实施方案中，术语“约”表示在所报告的数值的10%之内，优选在所报告的数值的5%之内。如本文所使用的，术语“回收”表示分离、纯化或转移利用本发明方法所生成的产物。分离和纯化来自反应混合物的产物的方法是本领域众所周知的，可包括但不限于选择性沉淀、结晶、过滤、反应性溶剂萃取、离子交換、电渗析、聚合、蒸馏、热分解、醇解以及它们的组合。在一个实施方案中，术语“回收”还可包括将反应混合物(通常在滤除酶催化剂之后)转移到另ー种反应中以产生ー种或多种额外的产物。如本文所使用的，术语“酶催化剂”或“微生物细胞催化剂”指具有用于将こ醇腈转化为こ醇酸和氨的腈水解酶活性特性的催化剂(即包含至少ー种具有腈水解酶活性的多肽)。酶催化剂可以完整的微生物细胞、透化处理的微生物细胞、微生物细胞提取物的ー种或多种细胞成分、部分纯化的酶或纯化的酶的形式存在。酶催化剂可以是游离的(未固定的)或固定在可溶性或不溶性支持物中或其上。如本文所使用的，“再循环的酶催化剂”指在分批反应中被再生为酶催化剂的酶催化剂。如本文所使用的，术语“催化剂生产率”和“酶催化剂生产率”指每克催化剂产生的产物总量。在本发明中，所述催化剂是腈水解酶(EC3. 5. 5. 7)，所产生的产物是こ醇酸和/或こ醇酸铵(取决于反应的pH)。一般而言，在基本上pH中性的条件下进行本发明方法，以便所产生的こ醇酸主要以こ醇酸相应的盐(即こ醇酸铵)的形式存在。一般来说，在具有催化剂再循环的分批反应中，随每一次循环反应催化剂活性而降低(酶失活)。如本文所使用的，术语“敏捷食酸菌(Acidovorax facilis) ”和“敏捷食酸菌(A. facilis)”可交換地使用，井指保藏在美国典型培养物保藏中心(国际保藏机构)，具有保藏号55746( “ATCC 55746”)的敏捷食酸菌72W。如本文所使用的,术语“大肠杆菌(Escherichia coli)”和“大肠杆菌(E. coli) ”可交換地使用。一些适合用于重组表达的大肠杆菌菌株描述于此，包括但不限于具有国际保藏编号ATCC 47076的大肠杆菌MG1655、具有国际保藏编号ATCC 53911的大肠杆菌FM5、具有国际保藏编号ATCC 27325的大肠杆菌W3110、具有国际保藏编号ATCC 35695的大肠杆菌MC4100和具有国际保藏编号ATCC 12435的大肠杆菌W1485。在一个实施方案中，适合的大肠杆菌菌株包括大肠杆菌FM5 (ATCC53911)和大肠杆菌MG1655 (ATCC 47076)。如本文所使用的，术语“大肠杆菌SS1001”或“SS1001”指表达敏捷食酸菌72W腈水解酶的转化的大肠杆菌菌株，具有ATCC登记号PTA-1177 (US 6，870, 038 ;其全文在此并入作为参考)。与野生型72W腈水解酶序列(SEQ ID NO :6)相比，重组表达的大肠杆菌SS1001腈水解酶(SEQ ID NO 38)含有2个小的序列改变。起始密码子由GTG变为ATG以利于重组表达，并在克隆过程中导入在C-末端附近引起单个氨基酸改变(Pro367[CCA] — Ser[TCA])的人工序列。如本文所使用的，术语“乙醇腈”缩写为“GLN”，并且与羟基乙腈、2-羟基乙腈、羟基甲腈以及CAS登记号107-16-4的所有其他异名同义。如本文所使用的，术语“乙醇酸”缩写为“GLA”，并且与羟基乙酸(hydroxyaceticacid)、轻基醋酸(hydroxyethanoic acid)以及CAS登记号79_14_1的所有其他异名同义。经本发明方法产生的乙醇酸可以质子化的羧酸和/或相应的铵盐的形式存在。如本文所使用的，术语“乙醇酸铵”缩写为“NH4GLA”。如本文所使用的，术语“乙交酯”指CAS登记号502-97-6的化合物。 如本文所使用的，术语“适合的含水乙醇腈反应混合物”和“适合的含水反应混合物，，指其中乙醇腈和酶催化剂得到接触的物质和水。如本文所使用的，术语“腈水解酶催化剂”指具有腈水解酶活性(EC3. 5. 5. 7)特性的酶催化剂。腈水解酶直接将脂族腈转化为相应的羧酸，不形成作为中间体的相应的酰胺(方程式I)。方程式I. O 腈水解酶 /I HO-CH2—CN -^ HO-CH2—C、+ NH3 H2OOH如本文所使用的,术语“改良的腈水解酶”、“腈水解酶突变体”、“敏捷食酸菌72W腈水解酶突变体”和“蛋白质工程的腈水解酶”可交换地使用来指在相同的反应条件下，与敏捷食酸菌72W腈水解酶的活性相比，具有明显改善的将乙醇腈转化为乙醇酸的腈水解酶活性的本发明的腈水解酶。在一个实施方案中，当重组表达(使用相同的表达系统)并在基本上相同的反应条件下测定时，可通过比较本发明突变的腈水解酶催化剂与天然的敏捷食酸菌72W腈水解酶的腈水解酶活性，测定腈水解酶活性的改善。SDS-PAGE分析显示本发明突变体及其相应的对照(SEQ ID N06)之间的蛋白表达水平是基本上相的敏感的。同样地，认为腈水解酶活性的改善是天然敏捷食酸菌72W腈水解酶结构修饰的结果。术语“腈水解酶活性”指当将乙醇腈转化为乙醇酸(或相应的乙醇酸铵)时，每单位质量(例如毫克)蛋白、细胞干重或珠子重量(固定的催化剂)的酶活性。比较测量的腈水解酶活性，与细胞干重或珠子重量成正比。由于使用SDS-PAGE凝胶的激光光密度分析，在量上难以区分在敏捷食酸菌72W对照(SEQ ID NO 6)和改良的突变体之间的腈水解酶表达水平，因此相对于细胞干重(dew)或珠子重量(bw)，比较并测量报道的改善的腈水解酶活性。如本文所使用的，术语“一单位酶活性”或“一单位腈水解酶活性”或“U”规定为在规定温度(如25°c )下，每分钟产生I μ mo I乙醇酸产物需要的酶活性的量(GLA U/g细胞干重或珠子重量)。如本文所使用的，术语“相对的腈水解酶活性”、“改善的腈水解酶活性”和“在腈水解酶活性方面相対的改善”指表示为參照(对照)腈水解酶活性的倍数(或分数)的腈水解酶活性。相对于使用天然敏捷食酸菌72W腈水解酶所观察到的腈水解酶活性，本发明突变的腈水解酶显示明显改善的腈水解酶活性。在本发明中，相对腈水解酶活性的“明显改善”是在相同的反应条件下，与对照(敏捷食酸菌72W腈水解酶；SEQ ID N06)的腈水解酶活性相比，至少I. 5倍更高的腈水解酶活性的改善。在另ー个实施方案中，在相同的反应条件下，与対照的腈水解酶活性相比，所述改善是至少2倍更高的腈水解酶活性。在另ー个实施方案中，在相同的反应条件下，与対照的腈水解 酶活性相比，所述改善是至少4倍更高的腈水解酶活性。如本文所使用的，术语“初始反应速率”在规定的反应条件下，こ醇腈转化为こ醇酸的速率的大小，其中刚ー添加乙醇腈到反应混合物中，就产生的反应速率的大小，其中在反应过程中こ醇腈浓度保持在高于约50毫摩(mM)的一段时间内測定反应速率。根据每单位时间产生的こ醇酸浓度(如摩尔こ醇酸/升/分钟或毫摩こ醇酸/小吋)的改变測定反应速率。如本文所使用的，术语“重组生物”、“转化宿主”、“转化体”、“转基因生物”和“转化的微生物宿主”指已用异源或外源DNA转化的宿主生物。本发明的重组生物表达编码活性腈水解酶的外源编码序列或基因。“转化”指DNA片段转移入宿主生物中。所述转移的DNA片段可在染色体或染色体外掺入(即通过载体)宿主生物中。如本文所使用的，“转化盒”指含有一组便于准备插入宿主细胞中的遗传元件的DNA特定片段，通常作为质粒的一部分。如本文所使用的，“表达盒”指含有一组便于准备插入宿主细胞中的遗传元件的DNA特定片段，通常作为质粒的一部分，还供在宿主中增强基因表达之用。如本文所使用的，术语“核酸片段”和“核酸分子”指可编码完整基因、编码序列和/或编码序列前(5'，上游)或后(3'，下游)的调节序列的DNA分子。在一方面，本发明的核酸分子编码具有腈水解酶活性的多肽。如本文所使用的，“基因”指表达特定蛋白的核酸分子。如本文所使用的，其可以或不必包括编码序列前的调节序列(5'非编码序列)和编码序列后的调节序列(3'非编码序列)。“天然基因”指在自然界中发现的带有其自身调节序列的基因。“嵌合基因”指不是天然基因的任何基因，包含在自然界中不同时出现的调节序列和编码序列。因此，嵌合基因可以包含来源于不同来源的调节序列和编码序列，或来源于相同来源的调节序列和编码序列，但排列方式与天然排列方式不同。“内源基因”指位于生物的基因组中的天然位点上的天然基因。“外源基因”指正常情况下不存在于宿主生物中的基因，但是所述基因是通过基因转移导入宿主生物中的。外源基因可包含插入非天然生物中的天然基因或嵌合基因。“转基因”是已通过转化操作导入基因组的基因。如本文所使用的，术语“编码序列”指编码特定氨基酸序列的DNA序列。如本文所使用的，“适合的调节序列”指影响转录、RNA加工或稳定性、或相关编码序列的翻译并位于编码序列的上游(5'非编码序列)、之中或下游(3'非编码序列)的核苷酸序列。调节序列可包括启动子、翻译前导序列、内含子和多腺苷酸化识别序列、RNA加工位点、效应子结合位点和茎-环结构。[0101]“启动子”指能控制编码序列或功能性RNA表达的DNA序列。一般而言，编码序列位于启动子序列的3'。启动子可以完全来源于天然基因、或由来源于天然存在的不同启动子的不同元件组成，或甚至包含合成的DNA区段。能使基因在大部分细胞类型中在大多数时间下或在大多数的环境条件下表达的启动子，通常称为“组成型启动子”。能使基因仅在特定化合物或环境条件存在下表达的启动子，通常称为“诱导型启动子”。由于在大多数情况下，调节序列的确切边界还未完全确定，因此不同长度的DNA片段可以具有相同的启动子活性。如本文所使用的，术语“可操作地连接”指核酸序列在单一核酸分子上的结合，使得一条序列的功能受另一条影响。例如，当启动子能影响编码序列表达时，其就是与编码序列可操作地连接的(即编码序列受启动子转录控制)。编码序列可沿有义或反义方向可操作地与调节序列连接。如本文所使用的，术语“3'非编码序列”指位于编码序列下游并包括多腺苷酸化识别序列(通常限于真核生物)和其他编码能影响mRNA加工或基因表达的调节信号的序列的DNA序列。多腺苷酸化信号(通常限于真核生物)一般特点在于影响多聚腺苷酸束添加到mRNA前体的Y末端上。本领域技术人员应充分意识到，在使用核苷酸密码子来表示所给定的氨基酸中，特定宿主细胞具有“密码子偏倚”。因此，当合成用于改善在宿主细胞中的表达的基因时，期望设计能使其密码子使用反映优选的宿主细胞密码子偏倚的基因。对其中序列信息可得到的来源于宿主细胞的基因的调查，可以确定其的密码子偏倚。密码子优化是本领域众所周知的，且已被描述用于不同的系统，包括但不限于酵母(Outchkourov等，Protein Expr Purif, 24 (I) :18-24(2002))和大肠杆菌(Feng 等,Biochemistry, 39 (50)15399-15409(2000))ο敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)腈水解酶敏捷食酸菌72W腈水解酶(EC 3.5.5. I)是一种用于由脂肪族或芳香族腈产生羧酸的稳定催化剂(wo 01/75077 ；US 6，870，038和Chauhan等，(同上))。还已显示能催化α -羟基腈(即乙醇腈)转化为α -羟基羧酸(即乙醇酸)(见US 6，383，786和US6，416，980 ;它们的全文在此并入作为参考)。所有已知的腈水解酶，包括敏捷食酸菌72W腈水解酶，在酶活性中心中都具有亲核的半胱氨酸(Cowan等,Extremophiles，2 :207-216(1998) ；Pace, H.和Brenner, C, GenomeBiology, 2 (I) reviews 1-9(2001);和 Chauhan 等，同上)且都易受硫醇试剂(I. OmM 浓度的氯化铜、硝酸银、乙酸汞或氯化铁，每一种都引起敏捷食酸菌72W腈水解酶酶活性大幅降低)影响而失活。半胱氨酸残基也能被不可逆地氧化为亚磺酸，导致酶活性损失。尽管腈水解酶对多种失活机制敏感，但是固定的敏捷食酸菌72W细胞是稳定的，在多次再循环反应后能保持其大部分腈水解酶活性(US 6，870, 038)。已报道了敏捷食酸菌72W腈水解酶与其他细菌腈水解酶的序列比较(US6，870, 038 ；Chauhan等，同上)。该72W腈水解酶具有几个保守的特征结构域,包括邻近氨基末端的16-氨基酸区(SEQ ID NO 6的氨基酸残基40-55)和含有必需半胱氨酸残基的催化区(SEQ ID NO 6的氨基酸残基160-173)。该半胱氨酸残基(SEQ ID NO 6的Cysl64)与保守的谷氨酸(SEQ ID NO 6的Glu48)以及赖氨酸残基(SEQ ID NO 6的Lys 130) 一起形成见于所有腈水解酶中的催化三联体基序(Pace，H.，和Brenner，C，同上)。尽管在所报道的腈水解酶之中某些结构相似性是保守的，但是底物特异性变化很大(O' Reilly,C.和Turner, P.，J Appl Microbiol,95 :1161-1174(2003))。突变的腈水解_特性之前已报道了ー些来源于敏捷食酸菌72W腈水解酶的突变的腈水解酶(US10/919182 ;在此并入作为參考)。在US 10/919182中，为了将3-羟基腈(即3-羟基丁腈和3-羟基戊腈)转化为3-羟基酸的腈水解酶活性的相对改善(相对于重组表达的、天然的72W腈水解酶的活性)，选择并筛选各种突变的腈水解酶。US 10/919182中所述的腈水解酶突变体使用的表达系统是基于质粒pTrcHis2-TOPO 和大肠杆菌宿主T0P10 (两者都来自于 Invitrogen，La JoIIa, CA)的。使用实施例12所述的方法，在相同的表达系统中比较腈水解酶突变体F168L(SEQ ID NO 6 中第168位残基由Phe变为Leu)、F168V (第168位残基由Phe变为VaI ；SEQ ID NO :32)、F168K (第168位残基由Phe变为Lys ;SEQ ID NO :26)、T210A(第210位残基由Thr变为Ala; SEQ ID NO 34)和 T210C (第 210 位残基由 Thr 变为 Cys ;SEQ ID NO :36)与天然的酶(“对照” ；SEQ ID NO 6)的活性。当将GLN转化为GLA时，突变体F168L、T210A和T210C最初被鉴定可能具有明显改善的腈水解酶活性，但是随后发现它们与72W腈水解酶对照具有类似的腈水解酶活性。出乎意料地，当将こ醇腈(ー种2-羟基腈)转化为こ醇酸吋，US10/919182 中所述的两种突变的腈水解酶(F168K，Phel68 —Lys ;F168V，Phel68 — VaI)(在此分别由SEQ ID NOs :26和32表示)也显示明显改善的腈水解酶活性。然而，当将こ醇腈转化为こ醇酸吋，US 10/919182中所述的其他突变的腈水解酶(如T210A，SEQ ID NO 34 ；T210C, SEQ ID NO 36)并没有显示明显改善的腈水解酶活性。如本申请实施例所述，易错PCR和定向饱和诱变用于随机突变天然的72W腈水解酶编码序列(SEQ ID N0:5)。导致在氨基酸残基第168位(在野生型序列中为苯丙氨酸)和第201位(在野生型序列中为亮氨酸)的氨基酸取代的突变似乎明显增加了腈水解酶活性。如本文所使用的，术语“氨基酸残基位置”指在相对于由N-末端甲硫氨酸残基起算的參照序列(SEQ ID NO 6)的特定位置上所见的氨基酸。进行定向饱和诱变以评估在两个残基位置(168和210)上的所有氨基酸取代。鉴定了ー些具有明显改善的将こ醇腈转化为こ醇酸(如在本发明的反应条件下，以こ醇酸铵盐的形式存在)的腈水解酶活性的额外的突变体。相对于敏捷食酸菌72W腈水解酶序列(SEQ ID NO :6)，本发明突变的腈水解酶包含至少ー个氨基酸取代。同样地，每ー个本发明突变的腈水解酶的氨基酸序列具有带有至少ー个如本文所述的氨基酸取代的氨基酸序列SEQ ID NO :6(參照序列)。在一个实施方案中，适用于本发明方法的突变的腈水解酶包含编码具有SEQ IDNO 6的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，所述氨基酸序列带有至少ー个选自以下的氨基酸取代a)在氨基酸残基第168位用赖氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸或缬氨酸取代；和b)在氨基酸残基第201位用谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、丙氨酸、半胱氨酸或苏氨酸取代；其中当将こ醇腈转化为こ醇酸时，所述多肽提供了至少I. 5倍的腈水解酶活性改善。在另ー个实施方案中，适用于本发明方法的突变的腈水解酶具有选自SEQ IDNOs :8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30和32的氨基酸序列。在又一个实施方案中，适用于本发明方法的突变的腈水解酶具有选自SEQ ID NOs :7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29和31的核苷酸序列。在一方面，本发明 包括编码具有腈水解酶活性的多肽的分离的核酸分子，所述多肽具有SEQ ID NO :6的氨基酸序列，所述氨基酸序列具有至少一个选自以下的氨基酸取代a)在氨基酸残基第168位用甲硫氨酸或苏氨酸取代；和b)在氨基酸残基第201位用谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、丙氨酸、半胱氨酸或苏氨酸取代；其中当在相同的反应条件下将乙醇腈转化为乙醇酸时，相对于敏捷食酸菌72W腈水解酶的腈水解酶活性，所述多肽提供了至少I. 5倍的腈水解酶活性的增加。在另一方面，本发明包括编码具有选自SEQ ID NOs :8、10、12、14、16、18、20、22、24、28和30的氨基酸序列的多肽的分离的核酸分子。在又一方面，本发明包括具有选自SEQID NOs :7、9、11、13、15、17、19、21、23、27和29的核酸序列的分离的核酸分子。在一方面，本发明包括具有腈水解酶活性的分离的多肽，所述多肽具有SEQ IDNO 6的氨基酸序列，所述氨基酸序列具有至少一个选自以下的氨基酸取代a)在氨基酸残基第168位用甲硫氨酸或苏氨酸取代；和b)在氨基酸残基第201位用谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、丙氨酸、半胱氨酸或苏氨酸取代；其中当在相同的反应条件下将乙醇腈转化为乙醇酸时，相对于敏捷食酸菌72W腈水解酶的腈水解酶活性，所述多肽提供了至少I. 5倍的腈水解酶活性的增加。在另一个实施方案中，本发明包括具有腈水解酶活性的多肽，所述多肽具有选自SEQ ID NOs :8、10、12、14、16、18、20、22、24、28 和 30 的氨基酸序列。通过将所测定的活性单位(U)除以催化剂重量计算腈水解酶活性。可根据纯化的蛋白质重量、细胞湿量、细胞干重或固定的催化剂(即使用角叉菜胶和/或GA/PEI-交联的催化剂/藻酸盐珠子)的重量测定催化剂重量。在本发明中，腈水解酶活性记录为每克细胞干重的活性单位(U/gDCW)或每克催化剂珠子的活性单位(比较固定的催化剂)。就基于细胞干重作为单位催化剂重量的腈水解酶活性比较，应当考虑腈水解酶蛋白产生的水平。测定不同转化体及它们各自对照之间的腈水解酶的表达水平，并观察到是基本上相同的(即当在相同的遗传背景中比较时)。因此。对于不同的突变体而言，所报道的腈水解酶活性的改善归因于酶结构上的改变。在相同的载体背景(pTrcHis2-TOPO 或Puci9)和宿主大肠杆T0P10 (Invitrogen)、大肠杆菌 FM5(ATCC 53911)或大肠杆菌 MG1655 (ATCC 47076)中表达突变的腈水解酶(以及敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)腈水解酶对照)的编码序列。相对的改善是基于与使用相同的载体和宿主背景的适当的对照比较的。SDS-PAGE分析(如使用激光光密度分析定量)证明了在每种突变体(和对照)中腈水解酶蛋白表达水平基本上相同(如由于使用相同的表达系统和宿主所预期的)。相对酶活性被记录为对不同突变的催化剂所测定的腈水解酶活性相对于在表达敏捷食酸菌72W腈水解酶(SEQ ID N06)的各自的大肠杆菌对照转化体中所测定的腈水解酶活性的倍数增加。[0127]对于未固定的催化剂，通过测定每克细胞干重在25°C下将こ醇腈转化为こ醇酸的转化率(ymol GLA/min)，确定突变的腈水解酶的腈水解酶活性(U/g细胞干重)。对于固定的催化剂比较，通过在25°C下测定こ醇腈转化为こ醇酸的转化率Omol GLA/min)来确定活性，并记录为每克固定的细胞催化剂珠子的腈水解酶活性単位(U/g珠子)。一単位的腈水解酶活性(U)相当于在25°C下毎分钟产生I微摩尔こ醇酸mol GLA/min)。对于特定的突变的腈水解酶，使用下列格式之一，关于敏捷食酸菌72W氨基酸序列(SEQ ID NO :6)，DNA编码区中的点取代突变以及所得到的氨基酸改变得到了详细说明I.扩展格式提供了 SEQ ID NO :6中野生型氨基酸(使用标准的3-字母縮写)和相应的氨基酸残基位置，之后是在相同的残基位置处见于突变体中的新氨基酸，例如。“Phel68改变为Lys”或“Phel68 — Lys”描述了ー种在SEQ ID NO 6中氨基酸残基第168位处作为突变的结果——苯丙氨酸被改变为赖氨酸的突变。2.简写形式野牛型氨基酸(表示为标准的单字母縮写)之后是SEQ ID N0:6的 氨基酸残基位置，再后是突变的氨基酸(也表示为标准的单字母縮写)。例如，“ F168K”描述了ー种在SEQ ID NO :6中氨基酸残基第168位处作为突变的结果——苯丙氨酸被改变为赖氨酸的突变。使用腈水解_催化剂将こ醇腈水解为こ醇酸通过将酶催化剂与包含こ醇腈的含水反应混合物接触进行水解反应。完整的重组微生物细胞(表达本发明的突变的腈水解酶)可用作为酶催化剂而无需任何预处理。微生物细胞催化剂可直接添加到反应混合物中，或使用中空纤维膜柱体或超滤膜保持与主体反应混合物分离。或者，微生物细胞可固定在聚合物基质(如角叉菜胶或聚丙烯酰胺(PAG)颗粒)中或固定在不溶性支持物(如硅藻土)上以便于酶催化剂回收和再生(US6，870，038)。纯化或部分纯化的酶也可分离自全细胞并直接用作为催化剂，或所述酶可固定在聚合物基质中或固定在不溶性支持物上。固定细胞或分离的酶的方法已得到广泛地报道并且是本领域技术人员众所周知的(Methods in Biotechnology,Vol. I :Immobilization of Enzymesand Cells ；Gordon F. Bickerstaff,编；Humana Press, Totowa, NJ, USA ；1997)。之前已报道了敏捷食酸菌72W腈水解酶催化剂的固定(US 6，870，038)。含水反应混合物中酶催化剂的浓度取决于酶催化剂的特定活性，并可选择以获得期望的反应速率。在水解反应中用作为催化剂的微生物细胞的细胞湿重通常为0. OOlg-O. 250g湿细胞/mL总反应体积，优选0. 002g-0. 050g湿细胞/mL。选择水解反应的温度以控制反应速率和酶催化剂活性的稳定性。反应温度可在仅仅高于反应混合物凝固点(大约0°c )至约65°C的范围内；优选反应温度在约5°C至约350C。可通过将细胞悬浮于蒸馏水中，或悬浮于可保持反应初始pH在约5. 0和约10. 0之间、优选在约5. 5和约8. 0之间、更优选在约5. 5和约7. 7之间以及最优选约6. 0至约7. 7的缓冲水溶液中制备微生物细胞催化剂悬浮液。当反应进行之吋，由于由相应的腈官能团形成羧酸铵盐，可改变反应混合物的pH。所述反应可运行直至完全转化こ醇腈，无需pH控制，或在整个反应过程中可添加适合的酸或碱以保持期望的pH。发现在25°C下こ醇腈能与所有比例的水完全混溶。在其中选择反应条件使得水相中底物(即a-轻基腈)的溶解性也取决于溶液温度和/或盐浓度(缓冲液或产物こ醇酸铵盐，也称为こ醇酸铵)情况下，反应混合物起初可由两相组成含有酶催化剂和溶解的α-羟基腈的水相以及有机相(不溶解的α-羟基腈)。当反应进行时，α -羟基腈溶解于水相中，并最终获得单相产物混合物。还可通过以大约等于酶促水解反应速率的速率添加α -羟基腈到反应混合物中运行反应，由此保持单相含水反应混合物，并避免在高的起始物料浓度下，潜在的酶底物抑制的问题。乙醇酸可作为质子化的羧酸和/或其相应的铵盐(取决于产物混合物的pH)的混合物存在于产物混合物中，并可额外地作为羧酸盐与任何能额外地存在于产物混合物中的缓冲液存在于产物混合物中。视所需，乙醇酸产物可作为质子化的羧酸或羧酸盐分离自反应混合物。在乙醇腈完全转化下，产物混合物中的乙醇酸的终浓度可在O. OOlM至乙醇酸产物的溶解度极限。在一个实施方案中，乙醇酸的浓度会约O. IOM至约9. 0M。在另一个实施方案中，乙醇酸的浓度在约O. 2M至约4. OM0通过用诸如的浓盐酸或浓硫酸的适合的无机酸调节反应混合物的PH为约I. O至约3. 0，并用适合的有机溶剂萃取乙醇酸，可从产物混合物 (在除去催化剂后)中分离乙醇酸。在一个实施方案中，所述适合的有机溶剂是Alamine 336( —种三烷基叔胺，其中烷基长度为C8-Cltl ；Cognis Corp. ,Cincinnati,OH)与一种或多种稀释剂的混合物，所述稀释剂选自甲基异丁基酮、I-辛醇、I-癸醇、甲苯、二甲苯(混合的)、煤油、甲基叔丁基醚和二氯甲烷(见共同未决的US临时专利申请60/638128 ;在此并入作为参考)。可利用水从有机溶剂中反萃取乙醇酸。在一个实施方案中，用氯化钠饱和有机溶剂，并将有机溶剂与适合的干燥剂(如硫酸镁)接触，过滤并除去溶剂(如通过旋转蒸发)以高产率和高纯度(通常98-99%纯)产生期望的产物。视所需，可通过重结晶或蒸馏进一步纯化产物。在另一个实施方案中，可利用直接脱氨和/或其他纯化方法从乙醇酸铵中直接分离乙醇酸，所述其他纯化方法包括但不限于浓缩、结晶、反应性溶剂萃取、离子交换、电渗析、糖醇解、聚合、蒸馏、热分解(盐裂化)、醇解以及它们的组合(见共同未决的US临时专利申请60/638148和60/638126 ;每一申请全文在此并入作为参考)。微牛物表汰可在异源宿主细胞中，优选在微生物宿主中产生本发明的腈水解酶突变体。在本发明中特别有用的是易于适应大规模发酵法的细胞。这样的生物体是工业生物工艺领域众所周知的，其例子可见 Recombinant Microbes for Industrial and ARriculturalApplicatio...
【专利技术属性】
技术研发人员：R迪科西莫，MS佩恩，A帕诺瓦，DP奥基夫，JS汤普森，
申请(专利权)人：纳幕尔杜邦公司，
类型：发明
国别省市：
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