一种乙醇酸氧化酶制剂、制备方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种黄花苜蓿乙醇酸氧化酶制剂，其制备方法及用于乙醇酸氧化以制备乙醛酸的应用。所述的乙醇酸氧化酶制剂是将植物黄花苜蓿汁液经过硫酸铵沉淀、冷冻干燥等步骤制备而得；亦可将硫酸铵沉淀所得的酶蛋白溶解、透析除盐后，上载于磁性纳米颗粒材料，即可制得磁粉固定化的乙醇酸氧化酶制剂。利用乙醇酸氧化酶作为生物催化剂，在温和的条件下催化乙醇酸有限氧化为乙醛酸，当底物浓度为５０～１０００ｍＭ时，乙醛酸的产率最高可达９８．９％。若使用磁粉固定化的乙醇酸氧化酶作为催化剂，则在反应结束后，可通过磁场作用很容易地将固定化酶从反应体系中分离出来，并可以多次反复使用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物化工领域，涉及黄花苜蓿乙醇酸氧化酶制剂、制备方 法及其用于催化乙醇酸氧化生产乙醛酸的应用。
技术介绍
乙醛酸(Glyoxylic acid， GA)，又名二羟醋酸、甲酰甲酸，是最简单的 醛酸，分子中包含醛基和羧基两种功能基团，因而兼有醛和羧酸的双重特 性，可同时发生醛、酸的反应，有时还会发生环化反应，是一种重要的有 机合成中间体。从乙醛酸出发，可以衍生出几十种有广泛用途的精细化工 产品，广泛应用于香料、医药、农药、食品添加剂等行业中。随着乙醛酸 应用范围的扩大及后继产品的开发，其市场容量不断加大，对产品的质量 提出更高的要求。加速研制、开发乙醛酸及其系列产品，对发展我国的乙 醛酸工业具有重要的意义。乙醛酸的合成方法包括化学合成法与生物合成法。工业上最常用的化 学合成法有草酸电解还原法、乙二醛硝酸氧化法、马来酸(酐)臭氧化法。一 般而言，化学合成法工艺复杂，生产成本高，能耗大，并且有较严重的环 境污染。以乙醇酸为底物，用乙醇酸氧化酶作为生物催化剂，进行乙醇酸 生物转化合成乙醛酸的生物合成法是现今乙醛酸生产的研究热点，与化学 合成法相比，具有能耗低，副产物少，环境污染小，产物的后续分离相对 简单等独特优点。随着环保措施的不断加强，通过生物法合成乙醛酸是一 种必然趋势。到目前为止，在生物法合成乙醛酸的研究中，使用的酶制剂主要是基因工程重组的菠菜乙醇酸氧化酶。例如，文献 / CT em., 1993, 58:2253-2259报道美国杜邦公司使用游离菠菜乙醇酸氧化酶作为催化剂，在 过氧化氢酶以及FMN、乙二胺等添加剂的存在下，催化乙醇酸氧化合成乙 醛酸。由于游离菠菜乙醇酸氧化酶的稳定性较差，反应需在低温(15。C)下进 行，游离酶无法重复使用。反应完毕后，通过对反应液加热处理，使游离 乙醇酸氧化酶变性沉淀，离心去除酶的沉淀后，才能从上清液中提取产物 乙醛酸。其后，杜邦公司直接使用含有酶的重组微生物细胞作为催化剂，催化 乙醇酸氧化合成乙醛酸，反应完毕后， 整细胞催化剂可以回收重复使用。由于存在较严重的细胞壁通透障碍，整 细胞催化剂在使用前必须用化学试剂进行通透处理，考虑到酶的稳定性， 反应仍然需在低温(5°0条件下进行。低温反应需要额外消耗能量，为了提高酶的温度稳定性，有必要对酶 进行改造或进行固定化。菠菜乙醇酸氧化酶的固定化已有专利报道(DavidL. Anton, "a/. US Patent 005， 439， 813A)，选用的载体是环氧树脂，酶活力回 收率低，仅为17%，而且商品化的环氧树脂价格昂贵，不适于大规模生产 应用。本专利技术针对以上局限，通过广泛筛选，发现植物黄花苜蓿(俗称"草头") 中存在高活力的乙醇酸氧化酶，这种植物的乙醇酸氧化酶尚未见文献报道。 与菠菜乙醇酸氧化酶相比，黄花苜蓿乙醇酸氧化酶性能优良，原料充足， 酶的提取简便，是生物合成乙醛酸的良好生物催化剂；我们还进一步开发 了一种简便、低成本且高效率的酶固定化方法，使用自行制备的纳米磁粉 材料，通过简单的物理吸附方法即可很容易地实现乙醇酸氧化酶的固定化； 在酶催化反应完成后，使用磁铁即可可以很容易地进行固定化酶的回收， 并且进行重复使用，工艺过程非常简单，经济成本也相对较低。5
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种黄花苜蓿乙醇酸氧化酶制剂；本专利技术的目的还提供一种上述黄花苜蓿乙醇酸氧化酶制剂的制备方法;本专利技术的另一目的是提供一种上述黄花苜蓿乙醇酸氧化酶制剂.本专利技术的乙醇酸氧化酶制剂是采用硫酸铵沉淀法自黄花苜蓿植物破碎 液中提取获得的可催化氧化乙醇酸生成乙醛酸的乙醇酸氧化酶。所述的乙 醇酸氧化酶的等电点pl > 9.0，反应的最适pH与反应温度分别为9.0和15°C ， 表观米氏常数尺m与Fmax分别为0.138 mmol/L和0.173 mmol'min力g蛋白。根据乙醇酸氧化酶是高等植物光呼吸途径中的关键酶这一特征，本发 明人对多种具有较强光呼吸的C3植物进行了乙醇酸氧化酶含量与活力的比 较。本专利技术的乙醇酸氧化酶筛选方法简述如下-(1) 初筛称取相同重量的不同种类C3植物的新鲜叶片，加入预冷的 缓冲液，研磨获得植物细胞破碎液，测定破碎液中乙醇酸氧化酶活力以及 蛋白质含量。(2) 复筛选定几种乙醇酸氧化酶活力比较高的植物进行详细的考察。 取研磨得到的植物细胞破碎液，加入乙醇酸进行转化反应，使用离子色谱 监测反应过程中产物与副产物的量。最后选择产物量高、副产物量低的植 物作为新的乙醇酸氧化酶来源。采用如下方法测定植物细胞破碎液中游离乙醇酸氧化酶的活力取2.5ml30。C预热的K2HPO4-KH2PO4缓冲液(100mM， pH8.0)，置于 光径1.0cm的石英比色皿中，加入0.3ml的盐酸苯肼溶液(50mM， pH 8.0) 以及0.1ml酶液，混匀后作为空白，在324nm处调零。加入0.1ml的乙醇 酸溶液(100mM， pH8.0)，立即混匀开始反应，在读数有变化时开始计时，记录30 s间隔吸光值的变化量。将上述反应条件下，1分钟内吸光值变化 0.1个单位所需要的催化剂(酶)量定义为一个酶活力单位(l U)。采用如下方法测定固定化乙醇酸氧化酶的活力称取一定质量的固定化酶，置于试管中，加入2 ml含50 mM乙醇酸的 三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris-HCl)缓冲液(pH9.0， 100 mM，含0.1mM黄素 单核苷酸FMN)， 30°C， 160rpm反应30min后取样100pL，将反应上清液 稀释适当倍数后，取0.4 ml置于试管中，加入0.2 ml的1% 3-甲基-2-苯并 噻唑酮腙(简称MBTH)溶液，摇匀后于30°C保温10 min，然后加入2.5 ml 的氯化铁溶液(0.2n/。,w/v)，摇匀后于30°C保温30 min，于紫外-可见分光光 度计上610 nm处测定吸光值。以0.4 ml甘氨酸-HCl缓冲液(IOO mM， pH 4.0) 加0.2 ml的1% MBTH溶液、2.5 ml的0.2%氯化铁溶液(保温相同时间)作为 空白对照。根据吸光值大小计算反应生成乙醛酸的摩尔量，进而根据二者 的对应关系换算为盐酸苯肼法测定的酶活力。通过反复筛选、比较，最终发现黄花苜蓿是乙醇酸氧化酶的理想新酶源。本专利技术的酶制剂的制备方法是使用黄花苜蓿新鲜叶片作为酶源，经细 胞破碎、缓冲液浸泡、提取后进行硫酸铵分级沉淀，在酶蛋白沉淀中添加 适量乳糖作为保护剂后，进行冷冻干燥即可获得乙醇酸氧化酶的粗酶制剂。 黄花苜蓿新鲜叶片破碎上清液与硫酸铵的重量比为1:(0.1 0.6);蛋白质与乳 糖的重量比为l:(0.5 2);蛋白质和粗酶粉制剂的区别在于后者是蛋白与乳 糖的混合物。这里所说的缓冲液是指磷酸盐缓冲液或者Tris-HCl缓冲液，缓冲液pH 为6~9。所述的Tris表示三羟甲基氨基甲烷。在此基础上，进一步将硫酸铵沉淀的粗酶蛋白制剂进行溶解和透析除 盐后，加入磁性纳米颗粒，通过物理吸附进行酶的固定化，即可获得磁粉固定化乙醇酸氧化酶制剂。酶蛋白与载体的质量比为1: (10-100)，固定化 温度为15。C 30。C，固定化时间为12~24小时。所述的蛋白质和透析缓冲 液重量比为(1 5): 1000;透析时间5 1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种乙醇酸氧化酶制剂，其特征在于：所述的乙醇酸氧化酶是采用硫酸铵沉淀法自黄花苜蓿植物破碎液中提取获得的可催化氧化乙醇酸生成乙醛酸的乙醇酸氧化酶。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：潘江，朱虹，胡彬，许建和，
申请(专利权)人：华东理工大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]