来源于细菌的丙酮酸脱羧酶(PDC)基因的克隆和测序及其用途制造技术

本发明专利技术提供编码丙酮酸脱羧酶的分离核酸分子，所述丙酮酸脱羧酶具有改进的脱羧酶活性，底物亲和性，热稳定性，和在不同ｐＨ值下的活性。本发明专利技术的核酸还具有允许在各种宿主细胞中高水平表达的密码子使用。因此，本发明专利技术提供含有这种核酸分子的重组表达载体，含有该表达载体的重组宿主细胞，进一步含有其它产乙醇酶的宿主细胞，以及使用这种宿主细胞生产有用物质，如乙醛和乙醇的方法。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
相关资料本申请要求下列美国申请的优先权名称为“活性胃八叠球菌丙酮酸脱羧酶在重组巨大芽胞杆菌中的高水平产生”的美国临时申请号60/288,638；名称为“来源于耐酸性厌氧革兰氏阳性菌胃八叠球菌的丙酮酸脱羧酶的克隆，表达，和表征”的美国临时申请号60/,288,671；名称为“巴氏醋杆菌丙酮酸脱羧酶生化，遗传，和生理性质”的美国临时申请号60/288,698；名称为“来源于醋酸菌巴氏醋杆菌的丙酮酸脱羧酶的生物化学及生物物理特征”的美国临时申请号60/288,622；名称为“丙酮酸脱羧酶一种利用巴氏醋杆菌氧化代谢乳酸的重要酶”的美国临时申请号60/288,699；以上全部申请都是在2001年5月4日提交的，并全文引入此处作为参考。本说明书自始至终引用的所有专利，专利申请，和参考文献的内容都全文引入此处作为参考。政府出资的研究这项工作由U.S.Department of Energy’s National RenewableEnergy Laboratory(ZDH-9-29009-04)，Energy BiosciencesProgram(FG02-96ER20222)，和Florida Agricultural ExperimentStation的基金部分资助。
技术介绍
很多环境和社会效益都是由于使用从植物材料获得的可再生燃料代替基于石油的汽车燃料而产生的(Lynd等，(1991)Science2511318-1323；Olson等，(1996)EnzymeMicrob.Technol.181-17；Wyman等，(1995)Amer.Chem.Soc.Symp.618272-290)。美国每年要燃烧掉1200亿加仑的汽车燃料，大约相当于进口石油的总量。作为一种可再生的替代燃料，乙醇的开发可消除美国对进口石油的依赖，改善环境，并提供新的就业机会(Sheehan，(1994)ACSSymposium Series No.566，ACS Press，pp 1-53)。理论上，解决用于汽车燃料的进口石油问题的方法似乎十分简单。除了使用石油这种有限的资源外，还可通过使植物材料发酵而有效生产可再生的资源——乙醇。事实上，巴西已经证实了生产乙醇的可行性，以及20多年来，乙醇作为一种主要汽车燃料的使用。同样，美国每年要生产超过12亿加仑的燃料乙醇。目前，燃料乙醇是利用啤酒糖酵母或运动发酵单胞菌从玉米淀粉或蔗糖生产的。然而，这两种糖源都不能供给可替换基于石油的汽车燃料所需的量。此外，蔗糖和玉米淀粉属于相对较贵的起始材料，并具有作为食品的竞争用途。此外，这些糖底物仅代表植物中全部碳水化合物的一部分。事实上，植物中的绝大部分碳水化合物都是以木质纤维素，即一种含有纤维素，半纤维素，果胶，和木质素的复合结构的聚合物形式存在的。木质纤维素存在于植物的茎，叶，皮，壳，和穗中。这些聚合物水解后释放出一种含有葡萄糖，木糖，甘露糖，半乳糖，以及阿拉伯糖的中性糖混合物。目前还没有天然的生物体能够迅速而且有效地把所有这些糖代谢成乙醇。然而，为了努力开发这种底物来源，Gulf Oil公司研究出一种利用以酵母为基础的称作同时糖化和发酵(SSF)的过程从纤维素生产乙醇的方法(Gauss等，(1976)U.S.P.N.3,990,944)。把真菌纤维素酶制品和酵母加入到单个容器中的纤维素底物匀浆中。乙醇在纤维素水解的同时产生。然而，Gulf’s SSF过程具有某些缺点。例如，酵母的细胞周期时间相对较长(24-36小时)，而且它们不能使复合糖发酵。此外，还不得不加入真菌纤维素酶，而直到目前为止，这样做仍然被认为是成本太高，不适于大规模的生物乙醇生产过程(Himmel等，(1997)Amer.Chem.Soc.pp.2-45；Ingram等，(1987)Appl.Environ.Microbiol.532420-2425；Okamoto等，(1994)Appl.Microbiol.Biotechnol.42563-568；Philippidis，G.，(1994)Amer.Chem.Soc.pp.188-217；Saito等，(1990)J.Ferment.Bioeng.69282-286；Sheehan，J.，(1994)Amer.Chem.Soc.pp1-52；Su等，(1993)Biotechnol.Lett.159779-984)。此外，利用其它生物体生产乙醇也很难，这是因为丙酮酸脱羧酶(PDC)，这种对于发酵乙醇而言很重要的酶，只在植物，酵母和真菌中普遍存在；很少存在于细菌中，在动物中则根本没有(9，25)。专利技术概述进行乙醇发酵的廉价酶方法的发展对于改进底物利用效率并使发酵过程更经济实用而言具有巨大的潜力。因此，研究酶和生物催化剂将十分有益，所述生物催化剂可生产这种酶，用于使复合糖有效解聚，随后迅速把糖发酵成醇。某些微生物，如革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌都可产生许多发酵酶，它们能催化纤维素和半纤维素解聚，从而产生可发酵的糖，糖转化成丙酮酸，底物丙酮酸转化成乙醛，最终，底物乙醛转化成乙醇。然而，这种生物很少会以最理想水平产生所有必需的酶。因此，本专利技术提供编码丙酮酸脱羧酶的基因，它可在各种生物体中高水平表达。因此当在生物体中表达，或与生物体一起培养时，产生乙醇发酵所需的重要酶，从而产生较高水平的乙醇。这些酶，例如丙酮酸脱羧酶(PDC)，可单独或与醇脱氢酶(ADH)联合用作具有所需活性的粗提物，或用作纯化的组合物。此外，生物催化剂，优选重组细菌，更优选产乙醇(ethanologenic)细菌，可被工程化表达这些酶活性的一种或多种，具体而言，它的量足以使糖发酵。这种生物催化剂适于有效降解复合糖，随后利用称作同时糖化和发酵(SSF)过程发酵成醇。本专利技术至少部分是以发现编码用于在细菌中发酵乙醇的重要酶的基因为基础的。具体而言，已经鉴定了棕榈发酵细菌，巴氏醋杆菌，和胃八叠球菌的pdc基因。这些基因已经被确定编码具有极高的丙酮酸脱羧酶活性，底物亲和性，例如对丙酮酸的亲和性，和热稳定性，以及在不同pH值下的极高的活性的丙酮酸脱羧酶。此外，本专利技术的pdc基因还具有在各种生物体中高水平表达的密码子使用。因此，一方面，本专利技术提供编码丙酮酸脱羧酶多肽(PDC)的分离核酸分子及其生物活性部分，以及适于用作检测编码PDC的核酸的引物或杂交探针的核酸片段。在其中一个实施方案中，本专利技术的丙酮酸脱羧酶(pdc)核酸分子是与SEQ ID NO1，3，5所示的核苷酸序列(如，当与核苷酸序列全长进行比较时)具有至少约50％，60％，70％，75％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或更多同一性的核酸分子，或其互补序列。在具体实施方案中，所述分离核酸分子含有SEQ ID NO1，3，5所示的核苷酸序列，或其互补序列。在另一实施方案中，pdc核酸分子含有编码一种多肽的核酸序列，所述多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO2，4或6的氨基酸序列足够同源。在具体实施方案中，pdc核酸分子含有编码(PDC)多肽的核苷酸序列，所述多肽与SEQ ID NO2，4和6所示的氨基本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离的核酸分子，选自：ａ）所含核苷酸序列与ＳＥＱＩＤＮＯ：１，ＳＥＱＩＤＮＯ：３，或ＳＥＱＩＤＮＯ：５的核苷酸序列至少６０％同源的核酸分子，或其互补序列；ｂ）含有一种核酸的至少０００个核苷酸的片段 的核酸分子或其互补序列，前一种核酸含有ＳＥＱＩＤＮＯ：１，ＳＥＱＩＤＮＯ：３，ＳＥＱＩＤＮＯ：５的核苷酸序列；ｃ）编码一种多肽的核酸分子，该多肽所含的氨基酸序列与ＳＥＱＩＤＮＯ：２，ＳＥＱＩＤ ＮＯ：４，或ＳＥＱＩＤＮＯ：６的氨基酸序列至少约５０％同源；ｄ）编码一种多肽的片段的核酸分子，该多肽含有ＳＥＱＩＤＮＯ：２，ＳＥＱＩＤＮＯ：４，或ＳＥＱＩＤＮＯ：６的氨基酸序列；其中该片段含有ＳＥＱ　 　ＩＤＮＯ：２，ＳＥＱＩＤＮＯ：４，或ＳＥＱＩＤＮＯ：６的氨基酸序列的至少１５个连续氨基酸残基；和ｅ）编码一种多肽的天然存在的等位基因变体的核酸分子，该多肽含有ＳＥＱＩＤＮＯ：２，ＳＥＱＩＤＮＯ： ４，或ＳＥＱＩＤＮＯ：６的氨基酸序列；其中所述核酸分子在严格条件下与含有ＳＥＱＩＤＮＯ：１，ＳＥＱＩＤＮＯ：３，或ＳＥＱＩＤＮＯ：５的核酸分子的互补序列杂交。...

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：JA毛平福尔罗，LA塔拉里科，KC拉，LO因格拉姆，
申请(专利权)人：佛罗里达大学研究基金会有限公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]