一种含有改组乙醇氧化酶启动子的毕赤酵母植酸酶表达系统技术方案

本发明专利技术涉及一种含有改组乙醇氧化酶启动子的毕赤酵母植酸酶表达系统，该表达系统中采用经过ＤＮＡ改组突变和筛选得到的ＡＯＸ１启动子，能够利用匍萄糖作为碳源，在简便的发酵条件获得酸性植酸酶的高效表达，从整体上降低生产成本。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及甲醇酵母表达系统，具体涉及含有改组乙醇氧化酶启动子的毕赤酵母植酸酶表达系统。
技术介绍
酵母作为一类外源基因的表达系统具有很多优点，酵母属于单细胞生物又具有真核生物的细胞结构，因而即保留了细菌易于操作和生长快速的特点，又具有糖基化、脂肪酰化、蛋白质磷酸化等翻译后修饰功能。大部分重组蛋白的表达以酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)为宿主表达系统。然而酿酒酵母表达蛋白通常存在产量低，自我复制表达型载体在细胞传代中不稳定，外源蛋白过糖基化作用等局限性。甲醇酵母是上世纪七十年代初期在研究利用甲醇为单一碳源和能量来源产生单细胞蛋白的过程中被发现的。甲醇酵母分为四类毕赤酵母属(pichia)、汉逊酵母属(hansenula)、念珠菌属(candida)和球拟酵母属(torulopsis)。其中以毕赤酵母属(pichia.pastoris)的遗传背景以及生理特征研究得较为透彻。甲醇酵母是一种甲基营养型酵母，在缺乏葡萄糖、甘油等抑制性碳源时，能利用甲醇作为唯一碳源。它含有乙醇氧化酶基因，其强的启动子受到甲醇的严格调控，可以用来驱动外源蛋白的高效表达。近年来，甲醇酵母系统由于其在蛋白表达方面所具有的优点而得到广泛的应用。甲醇酵母系统是一种真核表达系统，可以对表达的蛋白进行加工折叠和翻译后修饰；具有很高的表达量，已经达到了14.8g/L；节省成本，只需要简单的培养基；可以高密度发酵；背景杂蛋白少，表达产物容易纯化。毕氏酵母(Pichia pastoris)系统是近年来发展很快的一个真核表达系统，许多有活性的蛋白质已经在毕氏酵母系统中大量表达。毕氏酵母表达系统是真核表达系统，可以对表达的蛋白质进行加工折叠和修饰，还具有发酵方法成熟、发酵密度高、培养简单廉价、外源蛋白质既可以胞内积累又可分泌；表达产量高、背景蛋白质少易于表达产物纯化等优点。DNA改组是在与基因相关的DNA片段群体中，由于大量的随机相互参入而导致的重组或突变。20世纪80年代，Leder提出DNA改组(DNA shuffling)概念，期望能通过发现一个新的遗传系统增加基因DNA甚至RNA的改变。Stemmer建立了DNA改组的成熟技术，之后该技术发展迅速，利用该技术可以大大提高基因功能和改变基因的编码和结构，突变后的基因在序列、结构、功能上均显著区别于原来基因。短短二十年间，利用该技术在已成功地对许多功能基因进行了改造，取得了一系列研究成果，例如，获得了提高32000倍的β-内酰胺酶(β-lactamase)及荧光强度超过野生型45倍的绿色荧光蛋白(GFP)。通过DNA改组方法，Crameri等得到了高抗砷酸盐(arsenate)的菌株；Matsumura等成功对GUS基因进行突变，获得了在用戊二醛或甲醛固定植物材料中，GUS活性稳定的β-葡萄糖苷酸酶。目前可用于甲醇酵母表达的启动子有很多，其中大多数来源于甲醇酵母本身，如AOX1、AOX2、DAS、P40、GAP、FLD等。不同的启动子根据其在天然转录的蛋白在酵母中的作用不同而强弱不同。其中乙醇氧化酶启动子(AOX1)是使用最多、表达效率最高的一个启动子。在乙醇氧化酶启动子被分离、克隆，并建立了转化方法后，毕氏酵母已被发展成为一种高效的外源蛋白表达宿主。近年来，许多蛋白质在毕氏酵母中实现了高效表达，达到了克级水平，部分达到了十几克的高表达；但仍然有多种的蛋白质表达量相对较低。提高毕氏酵母外源蛋白质的表达量是降低工业化生产成本的关键。在菌株、培养条件、发酵等逐渐成熟的情况下，构建高表达的载体是提高外源基因表达量的一个关键因素。乙醇氧化酶启动子(AOX1)控制着乙醇氧化酶的表达机制，而乙醇氧化酶可催化甲醇的代谢反应。由于AOX1表达系统中需要使用甲醇，鉴于甲醇对细胞的毒性和甘油对甲醇诱导的弱抑制等因素，在发酵过程中必须先经过1-2天的甘油生长阶段，再通过补加甘油和其它成分，以及通过控制溶解氧含量和发酵环境的PH使细胞生长到合适的密度，最后才逐渐补加甲醇进行诱导表达。发酵过程中必须使细胞处于一段“饥饿期”，消耗发酵环境中的甘油。整个发酵周期需要10天左右，发酵过程较难控制。而且发酵过程中大量使用甘油。葡萄糖的成本远远小于甘油，用葡萄糖替代甘油作为碳源，可以节约发酵成本。但由于葡萄糖是表达的阻遏物，当AOX启动子用葡萄糖进行甲醇酵母发酵时，用甲醇诱导效果较低，因此必须去除发酵液中痕量的葡萄糖，才能够获得好的诱导表达效果，因而目前一般难以实现用葡萄糖作为碳源。寻找和发掘新的更好的甲醇酵母启动子具有重要的应用价值。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种含有改组乙醇氧化酶启动子的毕赤酵母植酸酶表达系统，该表达系统中采用经过DNA改组突变和筛选得到的AOX1启动子，能够利用葡萄糖作为碳源，在简便的发酵条件获得外源蛋白的高效表达，从整体上降低生产成本。本专利技术所提供的植酸酶表达系统包括(1)含有改组乙醇氧化酶启动子的甲醇酵母表达载体pYPX99质粒；(2)宿主毕赤酵母。本专利技术毕赤酵母植酸酶表达系统的构建方法由下列步骤组成1、乙醇氧化酶启动子(AOX1)突变体库的构建；本步骤通过DNA突变过程，包括AOX1启动子DNA片段的扩增，AOX1启动子DNA片段PCR产物用DNA酶降解得到小片段，小片段进行无引物的PCR扩增以及取无引物PCR产物为模板进行引物PCR扩增四步，获得AOX1启动子DNA片段的突变体库。(1)AOX1启动子DNA片段的扩增根据基因库Z46233(查阅网址http//www.ncbi.nlm.nih.gov)公布的乙醇氧化酶启动子核苷酸序列(见图1)，合成两个寡核苷酸引物。以含有AOX1启动子的质粒pPCI9为模板，扩增得到长度为940bp左右的AOX1启动子DNA片段。(2)回收DNA，回收的AOX1启动子DNA片段用DNA酶进行降解，形成弥散的片段，通过透析袋回收30-50bp的小片段。(3)回收产物进行无引物PCR扩增，形成200-400bp的弥散条带。(4)取无引物扩增产物为模板，加入引物进行PCR扩增，其扩增产物即为AOX1启动子DNA片段的突变体库。2、含AOX1启动子DNA片段的突变体库的甲醇酵母表达载体pYPX99质粒的构建本步骤是将回收的AOX1启动子DNA片段的突变体库经过BglII和HindIII双酶切后，植入含有报告基因酸性植酸酶的甲醇酵母表达载体pPCI9中，构建形成pYPX99质粒，其构建策略见图7。该质粒可以通过检测酸性植酸酶的活性筛选所需要的改组AOX1启动子。3、阳性酵母菌的筛选本步骤是将含有报告基因酸性植酸酶及突变的AOX1启动子库的表达载体pYPX99质粒转入宿主菌毕氏酵母，在以葡萄糖为碳源的培养基中培养，筛选得到良好表达酸性植酸酶的阳性酵母菌。(1)将构建好的含有报告基因酸性植酸酶的及突变的AOX1启动子库的表达载体pYPX99质粒通过电击转化大肠杆菌菌株DH5α，转化物涂布在含有氨苄青霉素的2YT培养基上，37℃培养过夜，进行建库，获得大于108个转化子。(2)将库进行质粒抽提，后电泳鉴定。(3)用限制性内切酶BglII对抽提质粒进行酶切，酶切产物电击转化毕氏酵母菌株，将转化子在含有葡萄糖为碳源的培养基中培养，离心去除培养本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种含有改组乙醇氧化酶启动子的毕赤酵母植酸酶表达系统，其特征在于包括：（１）含有改组乙醇氧化酶启动子的甲醇酵母表达载体ｐＹＰＸ９９质粒；（２）宿主毕赤酵母［Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ（Ｈｉｓ－Ｍｕｔ＋）］。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：姚泉洪，彭日荷，熊爱生，吴伟，刘承训，
申请(专利权)人：上海永业农科生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]