诱导型启动子的调控制造技术

本发明专利技术涉及异源多肽在重组细菌宿主细胞中的产生，其中使得所述细菌宿主细胞不能在诱导物不存在的情况下失活控制异源多肽表达的启动子。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】诱导型启动子的调控本专利技术涉及异源多肽在重组细菌宿主细胞中的生产。具体地，本专利技术涉及通过使用特定底物(诱导物)可诱导的启动子而调节编码多肽的异源核酸序列的表达。最具体地，本专利技术涉及异源多肽在细菌宿主细胞中的表达的调控，其中已使得细菌宿主细胞不能在诱导物不存在的情况下失活控制异源多肽表达的启动子。
技术介绍
异源多肽在重组微生物中的产生的一个重要方面是选择用于控制编码靶多肽的异源核酸序列的表达的启动子。适当的启动子应当比较强。S卩，以高速率产生相应mRNA，从而允许以较高的量产生多肽。此外，启动子应当容易受到调控并且仅在诱导时开始异源多肽的产生。然而，存在通常诱导底物为微生物的营养物并且被微生物消耗的问题。然而，当用于培养微生物的培养基耗尽诱导底物时，微生物使启动子失活，从而靶多肽的表达停止。为了避免基因表达的不希望的停止，必须以较高的量添加和/或连续补充诱导物。较高量的诱导物的需要增加了发酵工艺的成本。此外，需要昂贵诱导物的高效启动子的使用也受到限制。因此，为了生产重组多肽，需要其中控制异源多肽表达的启动子的活性不依赖于诱导物的存在、但异源多肽的表达仍然可被严密调控的宿主细胞。WO 2006/133210 A2涉及在利用甘露醇、阿糖醇、葡糖醇或甘油-诱导型启动子的细菌宿主细胞中生产重组多肽的方法，其中已使得细菌宿主细胞不能降解或代谢诱导物。根据所述方法，对基因组中编码代谢所述诱导物所需的酶的一个或多个基因进行了遗传改变或缺失，以便细胞不能从其基因组表达代谢或降解所述诱导物所必需的功能性酶。为了确保诱导物的摄入，不影响与诱导物转运至细胞内相关的基因。然而，该方法需要另外添加用于催化控制靶多肽表达的相应启动子的激活的诱导物。此外，诱导物在细胞中的积累可不利地影响细胞的发育。许多细菌能够利用不同的碳源。如果提供以碳源的混合物，则选择允许最快速生长的碳源(主要碳源)。同时牵涉次级碳源的利用的功能被称为碳分解代谢物阻遏(CCR)的现象抑制。除了 CCR外，参与较不优选的次级碳源的利用的特定分解代谢基因仅在所述次级碳源存在的情况下表达。因此，参与次级碳源的分解代谢的基因的表达依赖于所述次级碳源的存在(诱导)以及主要碳源(分解代谢抑制)的不存在。Tianqui Sun 等人的出版物 “Characterization of a mannose utilizationsystem in bacillus subtilis “，Journal of Bacteriology, American Society forMicrobiology,第192卷，第8期，2010年4月I日，第2128页至2139页涉及甘露糖操纵子及其基因以及受甘露糖调节的启动子PmanP和PmanR的鉴定。据报导，甘露糖的代谢受控于磷酸烯醇丙酮酸:碳水化合物磷酸转移酶系统，并且甘露糖操纵子还受控于碳分解代谢物阻抑。 为了表征和鉴定单个基因的功能，制备缺乏相应基因、从而不存在由所述基因编码的相应蛋白质的敲除突变体。已发现甘露糖转运蛋白基因manP的缺失导致从启动子PmanP和PmanR的组成型表达，这表明甘露糖转运蛋白ManP对甘露糖操纵子和编码甘露糖特异性转录调节剂ManR的manR基因的调控具有负作用。Tobisch 等人“Regulation of the lie operon of Bacillus subtilis andcharacterization of potential phosphorylation sites of the LiR regulatorprotein by site-directed mutangenesis，，，Journal of Bacteriology,第 181 卷，第 16期，1999年8月19日，第4995-5003页报导了:调节剂LicR的EIIA结构域中的磷酰基结合氨基酸替换为另一个氨基酸导致了诱导底物不存在的情况下突变调节蛋白LicR的活性。G ke 等人 “ Carbon catabolite repression in bacteria:Many ways to makethe most out of nutrients”, Nature Reviews.Microbiology,第6卷，第 8 期，2008 年8月，第613-624页涉及缺乏甘露糖转运蛋白EIIAB的链球菌属突变菌株和对磷酸烯醇丙酮酸:碳水化合物磷酸转移酶系统的影响。已显示甘露糖转运蛋白EIIAB并非仅限于甘露糖的磷酸化，而是同样地还磷酸化葡萄糖、果糖和2-脱氧葡萄糖。此外，已显示即使在甘露糖转运蛋白EIIAB不存在的情况下，甘露糖仍然可通过果糖特异性转运蛋白EIIfku摄入。Deutscher 等人“The mechanisms of carbon catabolite repression inbacteria，，(Current Opinion in Microbiology, Current Biology LTD, GB,第 11 卷，第2期，2008年4月I日，第87-93页)提供了不同细菌例如大肠杆菌(E.coli)和枯草芽孢杆菌(B.subtilis)中的碳分解代谢抑制机制的一般概述。专利技术概述本专利技术通过提供细菌宿主细胞而利用这些碳分解代谢的调控机制，其中所述细菌宿主细胞中，调控参与次级碳源代谢的基因表达的启动子在其相应的碳源不存在的情况下不被灭活，并且其中所述启动子仅处于碳分解代谢产物阻抑的控制之下。根据本专利技术，使用的`启动子为调控细菌宿主细胞的次级碳源的利用的启动子。在主要碳源存在的情况下，启动子被CCR抑制。当用于培养重组细菌宿主细胞的培养基耗尽主要碳源或主要碳源的浓度降至低于进行CCR所需的水平时，所述启动子的CCR无效并且启动子自动地起始由所述启动子控制的基因的表达。本专利技术提供了重组细菌宿主细胞，其中所述重组细菌宿主细胞能够利用一种以上的碳源，其中所述细菌宿主细胞的此类碳源的碳分解代谢受控于磷酸烯醇丙酮酸:碳水化合物磷酸转移酶系统(PTS)和CCR，其中对所述细菌宿主细胞进行了遗传改变，以防止在所述次级碳源不存在的情况下碳源诱导型启动子的转录调节蛋白的失活，但仍然在CCR的控制之下，其中所述碳源是细菌宿主细胞的次级碳源。根据本专利技术的又一方面，利用包含有效地连接了可被次级碳源诱导的启动子的编码多肽的异源核酸序列的载体转化本专利技术的重组细菌宿主细胞，其中载体的启动子受转录调节蛋白控制，所述细菌宿主细胞已在遗传上经历改变从而不能在特定相应碳源不存在的情况下灭活所述调节蛋白。此外，本专利技术提供了用于通过培养利用包含编码多肽的核酸序列的载体转化的本专利技术重组细菌宿主细胞来制备异源多肽的方法。此外，本专利技术涉及根据本专利技术的重组细菌宿主细胞用于产生异源多肽的用途。根据特定方面，本专利技术涉及需要减少量的诱导物、特别地根本不需要诱导物的基因表达诱导方案。根据进一步具体的方面，本专利技术涉及适合于高细胞密度发酵的细菌表达系统。具体地，本专利技术提供了用于在重组细菌宿主细胞中产生异源多肽的方法，其中使用重组细菌宿主细胞，其碳源的分解代谢处于碳分解代谢物阻抑和磷酸烯醇丙酮酸:碳水化合物磷酸转移酶系统的控制之下，并且其在遗传上本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于在重组细菌宿主细胞中生产异源多肽的方法，其中使用重组细菌宿主细胞，其碳源的分解代谢处于碳分解代谢物阻抑和磷酸烯醇丙酮酸：碳水化合物磷酸转移酶系统的控制之下，并且其在遗传上已被改变，从而不能在诱导性的次级碳源不存在的情况下灭活特异于可被该次级碳源诱导的启动子的转录调节蛋白；并且其包含具有有效地连接于启动子的编码多肽的异源核酸序列的载体，所述启动子可被次级碳源诱导并且受转录调节蛋白调控，所述方法包括包括如下步骤：在不包含所述诱导性次级碳源但包含不同碳源的细胞培养基中培养细菌宿主细胞，当该不同碳源的浓度降至低于碳分解代谢物阻抑所必需的水平时，由所述不同碳源诱导所述多肽表达，以及从细胞或从细胞培养物回收所述多肽。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：M·文泽尔，J·埃尔滕布克纳，C·基茨亚克，
申请(专利权)人：龙沙股份公司，
类型：发明
国别省市：瑞士;CH