本发明专利技术属于海藻基因工程技术领域，涉及一种海藻内源组成型启动子及其应用。启动子为SEQ ID NO:1所示核苷酸序列；对SEQ ID NO:1所示核苷酸序列进行一个或多个核苷酸的取代、缺失或添加所获得；或，与序列表中SEQ ID No:1限定的核苷酸序列具有90％以上同源性且具有转录起始作用的核苷酸序列。本发明专利技术采用染色体步移、基因克隆、DNA测序等技术得到浒苔肌动蛋白基因(actin)启动子，具有SEQ ID NO:1所示的序列；在此基础上将克隆的肌动蛋白基因启动子插入报告基因GUS上游，构建转化载体导入浒苔叶状体检测到GUS基因高效表达。该技术可以提高浒苔转基因效率和生物安全性，对藻种的品种改良以及基因工程产品开发都具有重要意义。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于海藻基因工程
，涉及一种海藻内源组成型启动子及其应用。
技术介绍
大型海藻属于低等植物，主要包括绿藻、褐藻与红藻。其中许多经济种类已实现规模化人工栽培，例如绿藻类的浒苔、石莼与礁膜，褐藻类的海带、裙带菜、羊栖菜，以及红藻类的紫菜、红毛菜、江蓠、石花菜和麒麟菜。目前全球大型海藻栽培总面积超过三百万亩，年产量超过600万吨鲜重，除部分作为营养食品外，也用于碘、甘露醇、藻胶等重要化工原料、以及海洋药物与蛋白试剂的提取原料，具有很高的经济价值。近年来，栽培海藻在新能源(如发酵产乙醇、甲烷)、新材料(如海藻多糖纺织纤维)、新型表达系统(重组制备蛋白类药物)等领域也表现出突出的应用潜力。为了实现海藻快速定向育种的需要，迫切需要发展高效、安全的海藻基因工程技术与全套方法。其中，针对导入基因的高效表达，启动子是一个重要的载体元件。启动子是基因的一个组成部分，是RNA聚合酶特异性识别和结合的DNA序列，控制基因表达(转录)的起始时间和表达的程度。启动子就像\开关\，其本身并不控制基因活动，而是通过与称为转录因子的蛋白质结合而控制基因的转录。目前，以海带、裙带菜、紫菜为代表的海藻遗传转化体系已经初步建立，导入外源功能基因在海藻中已经可以实现稳定表达。但是，由于使用的启动子元件多是来自陆地生物，由此也存在很多不足。例如，在高等植物中使用广泛的CaMV35S高效启动子(来自花椰菜花叶病毒)，在海藻中驱动外源基因表达的效率普遍较低；另外，海藻中使用最广泛的SV40启动子系来自灵长类猿猴空泡病毒，因此，外源启动子的使用带来大型海藻转基因低效表达与存在安全隐患两个突出问题。
技术实现思路
针对海藻基因工程对藻类自身来源组成型启动子的需求，本专利技术的目的是提供一种海藻内源组成型启动子及其应用。为实现上述目的，本专利技术采用技术方案为：一种海藻内源组成型启动子，浒苔肌动蛋白基因(actin)启动子为SEQIDNO:1所示核苷酸序列；对SEQIDNO:1所示核苷酸序列进行一个或多个核苷酸的取代、缺失或添加所获得；或，与序列表中SEQIDNo:1限定的核苷酸序列具有90％以上同源性且具有转录起始作用的核苷酸序列。优选，所述浒苔肌动蛋白基因(actin)启动子为SEQIDNO:1所示核苷酸序列。所述启动子系从海洋绿藻中获得。所述启动子系从石莼属(Ulva)植物中获得。进一步的说，利用分子生物学的染色体步移(genomewalking)技术、基因克隆技术、DNA测序技术克隆一种浒苔内源组成型肌动蛋白基因启动子pUpActin并测定其序列；在此基础上，利用克隆技术将所克隆的pUpActin启动子序列分别插入到β-葡萄糖苷酸酶(GUS)基因、加强型绿色荧光蛋白(EnhancedGreenFluorescentProtein,EGFP)基因、以及除草剂草丁膦抗性基因(bar)的上游，构建了系列浒苔转化载体，经转化，可实现导入外源基因的高效表达。海藻内源组成型启动子的应用，所述启动子在浒苔遗传育种中的应用。所述启动子在海藻品质改良和构建海藻表达系统中的应用。本专利技术提供的肌动蛋白(Actin)基因是生物界普遍存在的一种组成型表达基因，本专利技术所提供的浒苔肌动蛋白基因(actin)启动子名称为pUpActin，来源于大型经济绿藻——浒苔(Ulvaprolifera)。与现有方法相比，本专利技术具有如下有益效果：1.本专利技术通过染色体步移技术(GenomeWalking)得到浒苔肌动蛋白基因上游片段，经启动子功能验证后进一步设计了特异性扩增引物，可有效获得浒苔肌动蛋白启动子。2.在海藻转基因研究或应用中使用浒苔内源的肌动蛋白基因启动子，可以替代目前使用的动物病毒(如SV40、CMV)以及高等植物病毒(CaMV35S、AMT)来源的启动子，完全避免病毒核酸序列的引入，具有更高的生物安全性，有利于将来转基因海藻的应用。3.肌动蛋白是一个高水平组成型表达的蛋白，肌动蛋白基因启动子是一个高效表达的调控元件，用浒苔肌动蛋白基因启动子构建海藻转基因载体，其驱动外源基因的表达效率会显著提高。4.使用浒苔肌动蛋白基因启动子驱动选择标记基因(如除草剂草丁膦抗性基因bar)表达，通过提高抗性基因的表达水平，可以加大筛选试剂浓度(如草丁膦)，从而降低耐性克隆(假阳性)的产生，增加转基因抗性克隆(真阳性)比率，有效提高筛选效率。附图说明图1为本专利技术实施例提供的浒苔肌动蛋白基因5’上游序列生物信息学分析图。图2为本专利技术实施例提供的浒苔转化载体pUPA1-GUS示意图。图3为本专利技术实施例提供的浒苔转化pUPA1-GUS的定量检测结果。图4为本专利技术实施例提供的缘管浒苔转化pUPA1-GUS的定量检测结果。图5为本专利技术实施例提供的孔石莼转化pUPA1-GUS的定量检测结果。图6为本专利技术实施例提供的浒苔转化载体pUpActin-EGFP构建示意图。图7为本专利技术实施例提供的浒苔转化pUpActin-EGFP的荧光显微镜检测结果。图8为本专利技术实施例提供的浒苔转化载体pUpActin-bar构建示意图。图9为本专利技术实施例提供的浒苔转化pUpActin-bar的草丁膦抗性藻株的PCR检测结果。具体实施方式下面结合具体实施例，对本专利技术的元件及该元件所达到的效果作进一步详细说明。本专利技术浒苔内源组成型肌动蛋白基因启动子序列及其在获得转基因海藻中的应用；可有效提高转基因效率和生物安全性，对藻种的品种改良以及基因工程产品开发具有重要意义。实施例1：浒苔(U.prolifera)内源组成型肌动蛋白基因启动子pUpActin的克隆、测序与生物信息学分析1.浒苔肌动蛋白基因5’上游序列的克隆与测序利用天根公司的植物基因组DNA提取试剂盒按照常规方式制备浒苔总DNA模板，经0.8％的琼脂糖电泳检测，提取的浒苔基因组DNA条带清晰完整，可以满足PCR扩增需要。利用TaKaRa公司的(GenomeWalkingKit)染色体步移试剂盒，针对浒苔内源组成型肌动蛋白基因的5’上游序列，设计三条特异性引物(SP1:5’-CAAGGCAATCAGTAATGGACACG-3’；SP2:5’-GTGCCGAGGTCTGCCAACGATT-3’；SP3:5’-CCCGCAACAATCATCCTTCAAAA-3’)，根据试剂盒说明书进行染色体步移，将扩增得到的片段进行琼脂糖凝胶回收、TA克隆连接并进行核苷酸序列测定，获得肌动蛋白基因的5’上游序列共1941bp。2.浒苔肌动蛋白基因5’上游序列的生物信息学分析利用植物顺式作用元件的在线分析工具PLANTCARE(网址http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html)，经生物信息学分析发现，浒苔肌动蛋白基因5’上游序列存在TATA-Box、CAAT-Box及一些可能的启动子调控元件(见图1)，可以初步认定该序列具有启动子的功能。实施例2：浒苔肌动蛋白基因启动子pUpActin驱动报告基因GUS在海藻中表达1.浒苔肌动蛋白基因启动子片段的克隆与pUPA1-GUS载体构建根据实施例1获得的浒苔肌动蛋白基因5’上游序列，针对生物信息学预测的具有启动子活性的区域，设计浒苔肌动蛋白基因启动子pUpActin本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种海藻内源组成型启动子，其特征在于：浒苔肌动蛋白基因(actin)启动子为SEQ ID NO:1所示核苷酸序列；对SEQ ID NO:1所示核苷酸序列进行一个或多个核苷酸的取代、缺失或添加所获得；或，与序列表中SEQ ID No:1限定的核苷酸序列具有90％以上同源性且具有转录起始作用的核苷酸序列。
【技术特征摘要】
1.一种海藻内源组成型启动子，其特征在于：浒苔肌动蛋白基因(actin)启动子为SEQIDNO:1所示核苷酸序列；对SEQIDNO:1所示核苷酸序列进行一个或多个核苷酸的取代、缺失或添加所获得；或，与序列表中SEQIDNo:1限定的核苷酸序列具有90％以上同源性且具有转录起始作用的核苷酸序列。2.按权利要求1所述的海藻内源组成型启动子，其特征在于：所述浒苔肌动蛋白基因(actin)启动子为SEQIDNO:1所...
【专利技术属性】
技术研发人员：姜鹏，吴春辉，赵瑾，陈华新，
申请(专利权)人：中国科学院海洋研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37
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