ISKNV基因内含子及其在区分ISKNV活病毒与灭活病毒中的应用制造技术

本发明专利技术公开了ISKNV基因内含子及其在区分ISKNV活病毒与灭活病毒中的应用，属于病毒检测领域。所述内含子定位于传染性脾肾坏死病毒基因组NC_003494.1的ORF003L上，长度为80bp，记名为IN‑3。本发明专利技术首次公开了ISKNV的一个内含子，记名为内含子IN‑3。可以利用内含子IN‑3转录被剪切的特点，作为病毒是否灭活完全的指标，建立ISKNV灭活快速检测巢氏RT‑PCR方法，可以缩短ISKNV细胞灭活疫苗生产过程中灭活检验周期，提高疫苗生产效率。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于病毒检测领域，具体涉及ISKNVORF003L基因内含子及其在区分ISKNV活病毒与灭活病毒中的应用。
技术介绍
鳜(Sinipercachuatsi)是我国优质淡水鱼消费和出口创汇的重要品种，因其味道鲜美，蛋白质含量高而深受广大消费者的喜爱。然而严重的病害问题已成为限制鳜养殖业发展的主要瓶颈，自1997年以来，鳜暴发性传染病对鳜养殖业带来巨大的经济损失。吴淑勤等人首次确认了一种截面呈六角形，直径约150nm的大型球状病毒颗粒为鳜暴发性传染病的主要病原。由于该病毒主要感染鳜的脾脏和肾脏，何建国等人将其命名为传染性脾肾坏死病毒(Infectiousspleenandkidneynecrosisvirus,ISKNV)，隶属于虹彩病毒科肿大细胞病毒属，其全基因组测序已完成。由于传染性脾肾坏死病毒病发病率高、致病率高、造成经济损失大，其防控技术研究现已成为鱼病研究者重要课题之一。疫苗接种是预防鱼类病毒病最经济有效的手段，针对鳜鱼传染性脾肾坏死病毒，已有细胞灭活疫苗、重组亚单位疫苗、DNA疫苗的报道。而细胞灭活疫苗因具有制备简便、免疫效果稳定、研发周期短等优势而成为最具产业前景的疫苗之一。DONG等人报道了以MFF细胞系为扩增体系的ISKNV细胞培养灭活疫苗，其免疫保护率达到95％；FU等人建立了对ISKNV高敏感度的CPB细胞系，为ISKNV疫苗的制备提供了新的扩增体系；付小哲等人建立了检测ISKNV滴度的荧光定量PCR方法，为疫苗制备中病毒的定量提供了方便；罗霞等人优化了ISKNV同步接种培养条件，为细胞灭活疫苗规模化制备打下基础。病毒灭活检验是ISKNV细胞灭活疫苗制备中重要的一环，但传统病毒灭活检测方法是通过细胞盲传3代、同时通过接种鱼体验证病毒是否灭活完全，整个过程约需30天的时间，这大大延长了疫苗生产周期，降低了疫苗的生产效率，因此急需建立一种ISKNV灭活快速检验方法。病毒在细胞增殖过程中其相关基因持续转录，因此可通过对病毒mRNA进行监测而检验病毒是否灭活。刘令九等人采用细胞培养/链特异性RT-PCR方法建立了甲型肝炎(HepatitisA)灭活疫苗灭活验证方法；余芬等人采用链特异性RT-PCR建立了一种脊髓灰质炎病毒(poliovirus)灭活快速验证方法；Kim等人以黄瓜绿斑花叶病毒(Cucumbergreenmottlemosaicvirus,CGMMV)基因组热敏感区为靶标建立了该病的热灭活RT-PCR快速检测方法；但是在RT-PCR反应中存在一个主要的问题就是无法区分产物的扩增是来源于转录本mRNA还是残留基因组DNA，Nelson等人报道了一种去除病毒基因组DNA残留的RNA作为模板进行RT-PCR检测的方法，但要将总RNA中残留基因组DNA完全去除是很难达到的，且会造成RNA本身的损耗，降低检测的灵敏度。另外一种有效的方法是将包含内含子的病毒基因作为靶标设计特异性引物，通过PCR扩增片段大小来区分扩增产物模板来自基因组DNA还是mRNA。ChulHyunJoo等人以含内含子的巨细胞病毒糖蛋白B为靶标建立了一种区别活的巨细胞病毒与灭活病毒的RT-PCR方法，并应用于巨细胞病毒活性感染的诊断。Yuasa等人设计了一对跨两个外显子的引物通过RT-PCR监测锦鲤疱疹病毒(koiherpesvirus，KHV)mRNA来检测复制中的病毒。目前ISKNV的基因组已经公布(NC_003494.1)，基因组全长111362bp，含有124个ORF，但是尚未有任何文章报道过发现其含有内含子。因此没有针对内含子的病毒基因为靶标通过RT-PCR方法区分ISKNV活病毒与灭活病毒方法及试剂盒的相关报道。本专利技术从ISKNV感染CPB细胞系转录谱结果中筛选，首次发现ISKNV的一个内含子，位于ISKNV的基因组的ORF003L上，记名为内含子IN-3。根据只有活病毒可以转录，且转录后内含子被剪切的特点，利用内含子IN-3作为病毒是否灭活完全的指标，建立ISKNV灭活快速检测巢氏RT-PCR方法，旨在缩短ISKNV细胞灭活疫苗生产过程中灭活检验周期，提高疫苗生产效率。
技术实现思路
本专利技术公开了ISKNVORF003L基因内含子及其在区分ISKNV活病毒与灭活病毒中的应用。本专利技术所采取的技术方案是：一种传染性脾肾坏死病毒ORF003L基因内含子，其定位于传染性脾肾坏死病毒基因组NC_003494.1的ORF003L上，长度为80bp，记名为IN-3。传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)的基因组登录号为NC_003494.1，基因组全长111362bp，含有124个ORF。专利技术人在上述124个ORF进行分析和研究，并根据本实验室已有的ISKNV感染CPB细胞转录谱结果，与基因组序列比对后筛选出的4个Unigene，即ORF001L、ORF002L、ORF003L和ORF006L，实验结果表明，仅在ORF003L存在一个内含子，其余几个ORF序列上均无内含子存在。优选的，传染性脾肾坏死病毒ORF003L基因的内含子IN-3的序列如下所示：GAAAAGGCAGAGCACATCACATATTGTAAAGGCCATTATTATTGTTAATAATAATAACACACATTACTGTACACATACCT(SEQIDNO：1)。优选的，传染性脾肾坏死病毒基因组中ORF003L的序列为：ATGTCCTGGAGTCGCACAAAGGCCTTGTTGAGTAGCTCTACACGAGCCTCGTCGCACGGGGCGTCTGCTCGTATGGGTCCGCTGGATCGGCGTAGGACGTCGTGTGTAGCCACGGTATACAGCACAATGCAATTGTGCTCCGTCACACAGCTCTTGAGGTGGCTTATGCTGGTCGTGTTCAGGCGCTCCTGCGCAAAGTCAAACAGCTGTAGTTGCCCTGGTATGCGCCACTCGTTAACAGCCACCTGCTGGACCAGGCTGCAGTCAAACCCTCTAGCAGACACAAGACTACTGAGGTTCATAGCTGTCTACAACACAGACACTGCACCACAAGTCGAGATATTCAAAACACACACACATACAGACTTAAATCACTCTTTATTGTGTGATCATAGAGGCATATTTGACACTAACAGCACATGTGGGTTGCAGGGACCTACACAATATCATGAACACCTTAGACACTTTGTTGCCTTGCCTGCACGCATTGTCTATAAGTTTGCGTGCCCAATTGCGTATGTTTGTATCACATTTGATCGCCACCATCATGTCAGGCATGAGCATGCGCACATCCACCAGGCCATCCATCAACAGCATCAGGGTATGCCGGTCGGCAAACTCCGTCAAGAACGACATGCGAAGTGCCCGTAGCACACTTTCGTAGTCTGAAAAGGCAGAGCACATCACATATTGTAAAGGCCATTATTATTGTTAATAATAATAACACACATTACTGTACACATACCTTCGGTGGGAAACAGGTTCTCCCTCTTG本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种传染性脾肾坏死病毒ORF003L基因内含子，其定位于传染性脾肾坏死病毒基因组NC_003494.1的ORF003L上，长度为80bp，记名为IN‑3。

【技术特征摘要】
1.一种传染性脾肾坏死病毒ORF003L基因内含子，其定位于传染性脾肾坏死病毒基因组NC_003494.1的ORF003L上，长度为80bp，记名为IN-3。2.根据权利要求1所述的内含子，其特征在于：传染性脾肾坏死病毒ORF003L基因的内含子IN-3的序列如下所示：GAAAAGGCAGAGCACATCACATATTGTAAAGGCCATTATTATTGTTAATAATAATAACACACATTACTGTACACATACCT。3.权利要求1-2任一项所述的内含子在区分传染性脾肾坏死病毒ISKNV活病毒与灭活病毒中的应用。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：提取待测样品病毒总RNA，反转录得到cDNA，进行PCR扩增反应，获得扩增产物；如果扩增产物不含有内含子，则判定待测样品中含有ISKNV活病毒。5.一种灭活传染性脾肾坏死病毒的检测方法，其特征在于，包括下列步骤：提取待测传染性脾肾坏死病毒样品的总RNA，反转录得到cDNA，进行PCR扩增反应，获得扩增产物；如果扩增产物不含有内含子，则判定待测样品中含有ISKNV活病毒；所述内含子如权利要求1-2任一项所述。6.根据权利要求5所述的检测...

【专利技术属性】
技术研发人员：付小哲，李宁求，张醴溪，林强，梁红茹，刘礼辉，黄志斌，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院珠江水产研究所，
类型：发明
国别省市：广东;44