本发明专利技术提供了一种ZFNs介导的牛MSTN基因敲除和定点整合外源基因的方法，根据牛肌肉抑制素基因序列，设计ZFNs特异位点表达载体，并根据ZFNs作用位点设计含有外源基因的且可以整合至宿主基因组中的打靶载体，然后将上述表达载体和打靶载体共同转入牛的成纤维细胞中，获得牛肌肉抑制素基因敲除且定点整合外源基因的细胞；其中，设计特异的锌指蛋白核酸酶ZFNs，其作用的DNA序列位于牛MSTN基因的外显子上。本发明专利技术构建的锌指核酶介导的打靶载体为牛MSTN基因敲除和外源基因的定点插入提供了一种简便快速的途径，对“双肌”肉牛新品种的遗传育种具有重要价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物学领域，具体地说，涉及一种。
技术介绍
肌肉生成抑制素(MSTN)属于TGF-P超家族，是骨骼肌生长发育的负调控因子，其活性的丧失或降低，会造成动物肌肉的过度发育，而形成“双肌”(double muscle).自然界中有多种动物都有这种双肌现象，包括猪、狗、牛，甚至人也有这种性状出现。在自然选育的牲畜中，比利时蓝牛(Belgian Blue)和皮埃蒙特牛(piedmontese)是典型的双肌动物。二者都是由MSTN基因发生突变造成的，前者为MSTN序列第三个外显子中缺失了 Ilbp核苷酸，造成MSTN阅读框发生突变，产生的MSTN蛋白不能够发挥其生物活性；后者则在第一个外显子和第三个外显子中都发生了突变，其突变类型为碱基替换，使翻译出的MSTN蛋白中一个亮氨酸突变为苯丙氨酸，一个半胱氨酸突变为酪氨酸，最终造成了 MSTN蛋白失活(Kambadur, Sharma等，1997)。MSTN基因的发现为生物育种工作提供了新的思路。1997年McPherron等人获得了 MSTN基因敲除的小鼠模型，并且发现同龄的该小鼠比野生型小鼠在体重上增加30%,而且在成年鼠中，该表型不受年龄和性别的影响(McPherron, Lawler等，1997)。目前，国内肉牛品种中缺乏这种“双肌”的品种，如果能够获得这种MSTN突变型的肉牛品种，则能够提高我国的肉牛品质，增加肉牛饲养的收益。通过常规育种方式能够获得MSTN突变型肉牛，但是该技术选育速度慢，性状遗传不稳定。基因打靶技术是近年来发展起来的一种对细胞遗传信息进行修饰、修改，或者将外源基因导入的转基因技术，获得基因打靶的细胞后，再通过体细胞核移植技术和胚胎移植技术，可以最终获得转基因动物个体。这种`方法能够在一到两个代次内获得具有稳定遗传性状的个体，大大提高了动物改良和选育的速度。传统的基因打靶技术效率约10_7，效率较低，并且需要经过多种手段的筛选，最终得到的细胞代次高，细胞状态差。近年来，研究者将特异性识别DNA序列的锌指结构(Zinc finger)与非特异性切割DNA链的核酸酶相结合,开发出了能够对基因组的某一特异性位点识别并切割的锌指核酶(Zinc finger nuclease)。由锌指核酶介导的基因剪切具有较高的效率，能够达到10_2的水平，并且锌指核酶介导的同源重组效率高于传统的打靶技术。目前，该技术被广泛应用于植物、线虫、鱼、鸟类，以及哺乳动物细胞的基因修饰和转基因的实验研究中。而在针对牛MSTN基因的敲除和打靶上尚未有报道。鱼油里的长链不饱和脂肪酸《-3已经被证实有益于人类健康。动物肉类产品中包含有少量的食物(谷物)来源的《_3和大量的《 _6，高含量的《-6是导致冠状动脉硬化、癌症、糖尿病、关节炎以及抑郁症发生的主要原因之一。家畜体内由于缺少脂肪酸去饱和酶基因而不能将《_6转化成《_3，而低等动物线虫中具有行使这种转化功能的fat-1基因。将线虫fat-1基因经人源化修饰后的hfat-1基因，转入小鼠和猪，结果转基因小鼠和猪的肌肉里，《_3与《-6的比率可以提高至5倍。最近，有报道称成功培育了 fat-1转基因奶牛，但fat-1转基因肉牛的研究上未见报道。利用锌指核酶敲除肉牛MSTN基因，同时在锌指核酶切割位点定点整合hfat-1基因的研究未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种ZFNs介导的牛MSTN基因敲除和定点整合外源基因(如hfat-1基因)的方法。为了实现本专利技术目的，本专利技术的一种，其是根据牛肌肉抑制素基因序列，设计ZFNs特异位点表达载体，并根据ZFNs作用位点设计含有外源基因的且可以整合至宿主基因组中的打靶载体，然后将上述表达载体和打靶载体共同转入牛的成纤维细胞中，获得牛肌肉抑制素基因敲除且定点整合外源基因的细胞；其中，设计特异的锌指蛋白核酸酶ZFNs，其作用的DNA序列位于牛MSTN基因的外显子上。前述的方法，ZFNs作用的DNA序列优选位于牛MSTN基因的第2外显子和/或第3外显子上。前述的方法，ZFNs作用的 DNA 序列为:CTCATCAAACCCATGAAAGACGGTACAAGGTATACTGG 和 / 或 TTCCCAGAACCAGGAGAAGATGGACTGGTA。前述的方法，所述打靶载体含有根据ZFNs作用位点设计的牛MSTN基因5’同源臂和3’同源臂。 前述的方法 ，所述外源基因为脂肪酸去饱和酶fat-1基因，或fat-1基因经过人源化修饰后的基因(hfat-1基因)。前述方法包括如下步骤:方案1:I)构建bZFN-1和bZFN-2表达载体，它们的碱基序列分别如SEQ ID NO:1和SEQID NO:2 所示；2)根据ZFNs作用位点构建含有外源基因的且可以整合至宿主基因组中的打靶载体pflrk-1,其碱基序列如SEQ ID NO: 5所示；3)将上述表达载体和打靶载体共同转入牛的成纤维细胞中，通过PCR产物测序检测牛肌肉抑制素基因敲除且定点整合外源基因的细胞；和/或方案I1:I)构建bZFN-3和bZFN-4表达载体，它们的碱基序列分别如SEQ ID N0:3和SEQID NO:4 所示；2)根据ZFNs作用位点构建含有外源基因的且可以整合至宿主基因组中的打靶载体pflrk-2,其碱基序列如SEQ ID N0:6所示；3)将上述表达载体和打靶载体共同转入牛的成纤维细胞中，通过PCR产物测序检测牛肌肉抑制素基因敲除且定点整合外源基因的细胞。本专利技术还提供根据上述方法获得的牛肌肉抑制素基因敲除且定点整合外源基因的细胞。本专利技术还提供上述方法在生产牛MSTN基因敲除且定点整合外源基因的克隆牛中的应用。本专利技术还提供一种制备牛MSTN基因敲除且定点整合外源基因的牛克隆胚胎的方法，其以上述牛肌肉抑制素基因敲除且定点整合外源基因的细胞为核移植供体细胞，离体的卵母细胞为核移植受体细胞，通过核移植技术获得牛克隆胚胎。本专利技术还提供一种制备转基因牛的方法，其是将通过上述方法制备的克隆胚胎通过非手术法移入牛子宫内进行妊娠，获得转基因牛。具体地，本专利技术是从GenBank中获得MSTN全长DNA序列，针对第二外显子设计两套锌指核酶载体，分别命名为bMK-1和bMK-1I，其中bMK-1包括bZFN_l、bZFN_2两个质粒，bMK-1I包括bZFN-3和bZFN-4两个质粒(由Sigma-Aldrich公司完成)，通过脂质体共转染的方法，将两套锌指核酶载体分别导入不同的牛胎儿成纤维细胞中，再挑取单细胞建立多个单细胞株，将同一细胞株分为两部分，分别传代和冻存，对传代的细胞株提取基因组，使用跨作用位点的PCR检测引物进行扩增，扩增产物进行测序鉴定，最终得到在锌指核酶作用位点发生突变细胞株。从牛成纤维细胞获得基因组DNA，根据GenBank中报道的MSTN全长序列，分别设计针对锌指核酶作用位点的同源臂引物，通过PCR扩增出同源臂，通过连接克隆载体并进行限制酶切和测序鉴定为正确序列后，采用酶切和连接的方法将5’同源臂和3’同源臂分别连接到基础载体pCAGG-hfat-1-BGHpA的预期位置，最后通过限制酶酶切鉴定同源臂的正确性，最终获得针对bMK-1作用位点的打靶载体pflrk-1和针对bMK-1I作用位点的打靶本文档来自技高网...
【技术保护点】
ZFNs介导的牛MSTN基因敲除和定点整合外源基因的方法，其特征在于，其是根据牛肌肉抑制素基因序列，设计ZFNs特异位点表达载体，并根据ZFNs作用位点设计含有外源基因的且可以整合至宿主基因组中的打靶载体，然后将上述表达载体和打靶载体共同转入牛的成纤维细胞中，获得牛肌肉抑制素基因敲除且定点整合外源基因的细胞；其中，设计特异的锌指蛋白核酸酶ZFNs，其作用的DNA序列位于牛MSTN基因的外显子上。
【技术特征摘要】
1.FNs介导的牛MSTN基因敲除和定点整合外源基因的方法，其特征在于，其是根据牛肌肉抑制素基因序列，设计ZFNs特异位点表达载体，并根据ZFNs作用位点设计含有外源基因的且可以整合至宿主基因组中的打靶载体，然后将上述表达载体和打靶载体共同转入牛的成纤维细胞中，获得牛肌肉抑制素基因敲除且定点整合外源基因的细胞；其中，设计特异的锌指蛋白核酸酶ZFNs，其作用的DNA序列位于牛MSTN基因的外显子上。2.据权利要求1所述的方法，其特征在于，ZFNs作用的DNA序列位于牛MSTN基因的第2外显子和/或第3外显子上。3.据权利要求2所述的方法，其特征在于，ZFNs作用的DNA序列为:CTCATCAAACCCATGAAAGACGGTACAAGGTATACTGG 和 / 或 TTCCCAGAACCAGGAGAAGATGGACTGGTA。4.据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述打靶载体含有根据ZFNs作用位点设计的牛MSTN基因5’同源臂和3’同源臂。5.据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，所述外源基因为脂肪酸去饱和酶fat-1基因，或fat-1基因经过人源化修饰后的基因。6.据权利要求5所述的方法，其特征在于，包括如下步骤: 方案1: 1)构建bZFN-1和bZFN-2表达载体，它们的碱基序列分别如SEQID NO:1和SEQ IDN0:2...
【专利技术属性】
技术研发人员：李荣凤，李雪玲，赵宇航，云亭，梁浩，
申请(专利权)人：内蒙古大学，
类型：发明
国别省市：
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