ZFNs介导的牛MSTN基因敲除和定点整合外源基因的方法技术

本发明专利技术提供了一种ZFNs介导的牛MSTN基因敲除和定点整合外源基因的方法，根据牛肌肉抑制素基因序列，设计ZFNs特异位点表达载体，并根据ZFNs作用位点设计含有外源基因的且可以整合至宿主基因组中的打靶载体，然后将上述表达载体和打靶载体共同转入牛的成纤维细胞中，获得牛肌肉抑制素基因敲除且定点整合外源基因的细胞；其中，设计特异的锌指蛋白核酸酶ZFNs，其作用的DNA序列位于牛MSTN基因的外显子上。本发明专利技术构建的锌指核酶介导的打靶载体为牛MSTN基因敲除和外源基因的定点插入提供了一种简便快速的途径，对“双肌”肉牛新品种的遗传育种具有重要价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及分子生物学领域，具体地说，涉及一种。
技术介绍
肌肉生成抑制素(MSTN)属于TGF-P超家族，是骨骼肌生长发育的负调控因子，其活性的丧失或降低，会造成动物肌肉的过度发育，而形成“双肌”(double muscle).自然界中有多种动物都有这种双肌现象，包括猪、狗、牛，甚至人也有这种性状出现。在自然选育的牲畜中，比利时蓝牛(Belgian Blue)和皮埃蒙特牛(piedmontese)是典型的双肌动物。二者都是由MSTN基因发生突变造成的，前者为MSTN序列第三个外显子中缺失了 Ilbp核苷酸，造成MSTN阅读框发生突变，产生的MSTN蛋白不能够发挥其生物活性；后者则在第一个外显子和第三个外显子中都发生了突变，其突变类型为碱基替换，使翻译出的MSTN蛋白中一个亮氨酸突变为苯丙氨酸，一个半胱氨酸突变为酪氨酸，最终造成了 MSTN蛋白失活(Kambadur, Sharma等，1997)。MSTN基因的发现为生物育种工作提供了新的思路。1997年McPherron等人获得了 MSTN基因敲除的小鼠模型，并且发现同龄的该小鼠比野生型小鼠在体重上增加30%,而且在成年鼠中，该本文档来自技高网...

【技术保护点】
ZFNs介导的牛MSTN基因敲除和定点整合外源基因的方法，其特征在于，其是根据牛肌肉抑制素基因序列，设计ZFNs特异位点表达载体，并根据ZFNs作用位点设计含有外源基因的且可以整合至宿主基因组中的打靶载体，然后将上述表达载体和打靶载体共同转入牛的成纤维细胞中，获得牛肌肉抑制素基因敲除且定点整合外源基因的细胞；其中，设计特异的锌指蛋白核酸酶ZFNs，其作用的DNA序列位于牛MSTN基因的外显子上。

【技术特征摘要】
1.FNs介导的牛MSTN基因敲除和定点整合外源基因的方法，其特征在于，其是根据牛肌肉抑制素基因序列，设计ZFNs特异位点表达载体，并根据ZFNs作用位点设计含有外源基因的且可以整合至宿主基因组中的打靶载体，然后将上述表达载体和打靶载体共同转入牛的成纤维细胞中，获得牛肌肉抑制素基因敲除且定点整合外源基因的细胞；其中，设计特异的锌指蛋白核酸酶ZFNs，其作用的DNA序列位于牛MSTN基因的外显子上。2.据权利要求1所述的方法，其特征在于，ZFNs作用的DNA序列位于牛MSTN基因的第2外显子和/或第3外显子上。3.据权利要求2所述的方法，其特征在于，ZFNs作用的DNA序列为:CTCATCAAACCCATGAAAGACGGTACAAGGTATACTGG 和 / 或 TTCCCAGAACCAGGAGAAGATGGACTGGTA。4.据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述打靶载体含有根据ZFNs作用位点设计的牛MSTN基因5’同源臂和3’同源臂。5.据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，所述外源基因为脂肪酸去饱和酶fat-1基因，或fat-1基因经过人源化修饰后的基因。6.据权利要求5所述的方法，其特征在于，包括如下步骤: 方案1: 1)构建bZFN-1和bZFN-2表达载体，它们的碱基序列分别如SEQID NO:1和SEQ IDN0:2...

【专利技术属性】
技术研发人员：李荣凤，李雪玲，赵宇航，云亭，梁浩，
申请(专利权)人：内蒙古大学，
类型：发明
国别省市：