一种由根癌农杆菌介导的丝状真菌基因RNA干扰方法技术

本发明专利技术公开一种根癌农杆菌介导的适于多种丝状真菌基因研究用的RNA干扰方法，其通过基因重组及干扰体系筛选的方法获得了适于根癌农杆菌转染的重组载体PCB309-pfgrt，并且优化了根癌农杆菌的转化体系。本发明专利技术解决了丝状真菌RNA干扰载体构建困难及干扰效率低下的问题。在丝状真菌基因功能及遗传转化方面具有广泛的应用前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于RNA干扰
具体涉及一种重组载体PCB309-pfgrt、用于转染的根癌农杆菌，以及由根癌农杆菌介导的丝状真菌基因RNA干扰方法。
技术介绍
RNA干扰是真核生物中相对保守的基因沉默机制，它通过内源或外源双链RNA介导细胞内mRNA发生特异性降解或翻译的抑制，从而导致靶基因的表达沉默，并产生相应的功能表型缺失。1992年，Macino首次在粗糙脉胞菌中发现真菌中存在RNAi的现象后，RNAi技术渐成为一种对真菌进行遗传改造的新手段。在丝状真菌中RNAi技术具有特殊的优势:不受丝状真菌的多核现象、异核现象和非同源重组频率高的干扰，特别是当需要使多个基因的表达同时下调时，使用RNA干扰比基因敲除更加方便。然而，真正将RNAi技术用在丝状真菌的各项研究时还存在很多问题:真菌细胞多为多倍体，细胞壁含有较多的多糖及多糖蛋白等成分，使得RNA沉默的效果并不如在原生、动物细胞中理想，存在干扰效率低下、有脱靶效应等缺陷。因此选择恰当的遗传转化方法并制备合适的转染载体，可以更高效的导入siRNA，保证导入siRNA的稳定性，有效延长RNAi的作用时间，进而大大提高靶基因抑制效率本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组载体PCB309?pfgrt，其碱基序列为SEQ?ID?NO.21。

【技术特征摘要】
1.种重组载体PCB309-pfgrt，其碱基序列为SEQ ID N0.21。2.权利要求1所述的一种转染重组载体PCB309-pfgrt的根癌农杆菌。3.权利要求2所述的转染重组载体PCB309-pfgrt的根癌农杆菌，其特征在于，所述的根癌农杆菌为根癌农杆菌EHA105。4.据权利要求3所述的转染重组载体PCB309-pfgrt的根癌农杆菌，其特征在于，其通过以下方法制备: (a)将重组载体PCB309-pfgrt采用电击的方法转化根癌农杆菌EHA105感受态细胞；再用含有抗生素Kan50mg/ml和利福平25mg/的LB培养基筛选阳性克隆； (b)用引物SEQID N0.9和10对步骤(a)筛选的阳性克隆进行PCR鉴定。5.据权利要求4所述的转染重组载体PCB309-pfgrt的根癌农杆菌，其特征在于，所述的PCR鉴定条件为:94°C预变性Imin ;94°C变性30sec，55°C退火45sec，72°C延伸2min，30 个循环；72°C IOmin。6.种丝状真菌基因R...

【专利技术属性】
技术研发人员：张振颖，侯彬彬，刘晓明，
申请(专利权)人：张振颖，侯彬彬，刘晓明，
类型：发明
国别省市：