本发明专利技术公开了一种重组乙醇氧化酶rAOX的表达与纯化的方法。本发明专利技术运用分子生物学技术先构建乙醇氧化酶-多聚组氨酸表达载体pPIC9K-AOX-HIS，然后将其线性化后转入毕赤酵母GS115中，从而获得能够表达有活性的重组乙醇氧化酶的毕赤酵母工程菌，且重组乙醇氧化酶可以部分分泌表达。通过对重组乙醇氧化酶表达条件进行优化，该工程菌生产的乙醇氧化酶可达到1862U/L。同时，酶的分泌表达与多聚组氨酸标签的引入简化了重组乙醇氧化酶的纯化工艺。通过测定，该工程菌表达的重组乙醇氧化酶热稳定性较毕赤酵母野生型乙醇氧化酶有很大的提高。本发明专利技术的整个过程操作简单，可适合于工业化生产，可带来一定经济效益。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种重组乙醇氧化酶的表达与纯化的方法。更具体地说，涉及。
技术介绍
乙醇氧化酶是甲醇代谢的重要用酶，它可以催化甲醇及其他低级醇类并将其氧化生成其相应的醛类与过氧化氢。乙醇氧化酶的活性形式为一个分子量为600kDa的同源八聚体，并定位于细胞的过氧化物酶体中。乙醇氧化酶的每一个亚基都含有一个黄素腺嘌呤二核苷酸辅酶。乙醇氧化酶的亚基是在细胞周质中形成，与黄素腺嘌呤二核苷酸结合后进入过氧化物酶体进行八聚体的组装。乙醇氧化酶可以有效的通过消耗氧气来催化甲醇及其他低级醇类，事实上，很多基于氧电极的乙醇检测器都是利用固定化的乙醇氧化酶作为其主要介质。基于乙醇氧化酶的乙醇生物检测器在发酵，环境及食品工业等方面有重要的应用。该生物检测器存在以下几个优点(1)对低级醇类的高度亲和，检测精密度高；( 该酶的活性形式具有高度稳定性，检测寿命长；C3)在发酵工业，环境工程和食品工业方面检测的实用性强。乙醇氧化酶的商业化应用的两个重要瓶颈因素是酶的大批量生产与酶的纯化工艺。从野生菌毕赤酵母，假丝酵母，汉逊酵母中分离纯化乙醇氧化酶已有报道，但在这些野生菌中，乙醇氧化酶的表达均为胞内表达，胞内表达的酶相较于胞外来说更难纯化，这样会增加乙醇氧化酶的生产成本。仅嗜热子囊菌NBRC31693可以在胞外表达乙醇氧化酶，但其产量很低，仅为133U/L。从重组表达方面来说，乙醇氧化酶的异源表达已有过报道，例如在酿酒酵母和大肠杆菌中都进行过乙醇氧化酶的重组表达，虽然表达是成功的，但表达的酶却没有活性。其原因主要归结于乙醇氧化酶的活性结构的装配不仅需要黄素腺嘌呤二核苷酸辅酶，还需要有特殊的装配环境“过氧化物酶体”。因此，为满足乙醇氧化酶的大量工业化生产及应用，首先需要克服的是乙醇氧化酶的高表达以及其纯化工艺的简化。本专利技术的目的是提供一种乙醇氧化酶的重组表达与纯化的方法，以期利用该毕赤酵母工程菌大规模的发酵与纯化乙醇氧化酶。
技术实现思路
针对现有乙醇氧化酶表达及纯化存在的不足之处，本专利技术的目的是提供一种在毕赤酵母中重组表达和纯化乙醇氧化酶的方法，利用增加乙醇氧化酶的拷贝数与对发酵条件优化来提高重组乙醇氧化酶的表达量，特别是以麦芽糖为碳源，解除碳源对乙醇氧化酶表达的抑制，使重组乙醇氧化酶的表达量得到提高，且重组乙醇氧化酶可部分分泌到胞外。利用添加的多聚组氨酸融合标签可以达到简化乙醇氧化酶的纯化工艺的目的；另外，多聚组氨酸融合标签的添加提高了重组酶的热稳定性。该方法通过如下步骤实现的1)乙醇氧化酶基因的扩增根据NCBI上的毕赤酵母GS115的乙醇氧化酶的基因序列，设计一对引物，上游引物5，-CCGGAATTCATGGCTATCCCCGAAGAGTT-3，，下游引物:5，-A TTTGCGGCCGCTTATTAATGGTGATGGTGATGGTGGATCTAGCAAGACCGGTC-3，，在两条引物上分别加上 EcoR I和Not I限制性内切酶位点，并在下游引物上添加多聚组氨酸标签的基因，利用聚合酶链式反应，得到带组氨酸标签的乙醇氧化酶的DNA ；2)重组表达载体的构建将目的基因定向克隆进用同样的内切酶双酶切过的表达载体pPIC9K上，得到含有乙醇氧化酶的重组表达载体PPIC9K-A0X-HIS，将该重组表达载体PPIC9K-A0X-HIS转化到大肠杆菌DH5ci感受态中，然后，涂布在含氨苄霉素与卡那霉素的LURIA-BERTANL平板上，培养过夜，随机挑取平板上生长的菌落，碱法抽提质粒DNA，双酶切鉴定；3)将重组表达载体电转化到毕赤酵母GS115中在透明的1. 5ml聚苯乙烯灭菌管中加入85 μ 1终浓度为1. 0 μ g/ μ 1的重组表达载体、3_5 μ 1线性化酶和10 μ 1缓冲液，轻轻混勻，37°C下放置3-6小时，进行重组表达载体的线性化，得到线性化重组质粒；同时，根据^witrogen公司的《毕赤酵母表达手册》制备毕赤酵母GSl 15感受态，取出100 μ 1制备好的毕赤酵母GS115感受态与1-3 μ g上述的线性化重组质粒混合，转入电转杯，冰浴5分钟，进行电转化，电转化结束后立即加入Iml酵母膏胨葡萄糖培养基，混合均勻后涂于最小葡萄糖培养基平板上，于条件下培养2-4天；上述酵母膏胨葡萄糖培养基为10g/L酵母提取物、20g/L蛋白胨和20g/L葡萄糖， PH7. 0 ；上述最小葡萄糖培养基平板为13. 4g/L无氨基酵母氮源、0. %ig/L生物素、20g/L葡萄糖和15-20g/L琼脂粉；4)多拷贝转化子的筛选将最小葡萄糖培养基平板上的转化菌落点在含抗生素 G418的酵母膏胨葡萄糖培养基选择平板上，筛选出抗生素G418浓度为2. 0-4. Omg/ml的菌株；5)重组菌株的诱导表达将步骤4)筛选出的菌株接种于5ml酵母膏胨葡萄糖培养基中，在200转/分钟转速、30°C下培养过夜，得到种子液，然后，把种子液接种到缓冲复合甘油培养基或YPM培养基的摇瓶中，种子液与缓冲复合甘油培养基或YPM培养基的体积比为1 100，在200转/分钟转速、30°C下培养M小时；在1500-3000转/分钟转速、室温下离心5分钟，收获酵母沉淀，用体积浓度1 % -5%甲醇的缓冲复合甲醇培养基或YPM培养基悬浮酵母，使菌体细胞浓度=1-2，每隔M小时添加体积浓度-5%的甲醇，诱导表达48-96小时，得到表达重组乙醇氧化酶蛋白的发酵液；上述缓冲复合甘油培养基为20g/L蛋白胨，10g/L酵母提取物，IOOmM(毫摩尔)， PH6. 0磷酸钾缓冲液，13. 4g/L无氨基酵母氮源，体积浓度1 %甘油；上述缓冲复合甲醇培养基为20g/L蛋白胨，10g/L酵母提取物，100mM，pH6. 0磷酸钾缓冲液，13. 4g/L无氨基酵母氮源；上述YPM培养基为10g/L酵母提取物、20g/L蛋白胨和10-50g/L碳源，pH5. 0-9.0，碳源为葡萄糖，麦芽糖，淀粉，蔗糖或甘露糖；6)胞外重组乙醇氧化酶蛋白的纯化将上述步骤幻所得到的表达重组乙醇氧化酶蛋白的发酵液离心，取上清用体积浓度33%丙酮在_20°C下沉淀，然后，在4°C、13000转 /分钟转速下离心，得到的沉淀用平衡缓冲液进行重悬，再在4°C、13000转/分钟转速下进行离心，取上清；用10倍柱体积的平衡缓冲液平衡镍离子亲和层析柱，加入上述上清并使5其在柱内平衡，再用平衡缓冲液冲洗镍离子亲和层析柱，然后，用洗脱液洗脱结合到镍离子亲和层析柱上的重组乙醇氧化酶，得到纯化的胞外重组乙醇氧化酶蛋白；上述的平衡缓冲液pH8. 0，其成分为20mM Tris-HCl,0. 5M NaCl，20mM咪唑，上述的洗脱液 pH8. 0，其成分为 20mM Tris-HCl，0. 5M NaCl，250mM 咪唑；7)胞内重组乙醇氧化酶蛋白的纯化将上述步骤幻中所得到的表达重组乙醇氧化酶蛋白发酵液离心，所得的酵母沉淀经蒸馏水洗后用平衡缓冲液进行重悬，然后用超声波进行破碎，超声条件功率300瓦，工作7秒，间隔5秒，重复60次，超声波破碎的溶液在 413000转/分钟条件下离心，取上清；用10倍柱体积的平衡缓冲液平衡镍离子亲和层析柱，加入上述上清并使其在柱内平衡，用平衡缓冲液冲洗镍离子亲和层析柱，然后，用洗脱本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：徐志南，刘云平，朱建忠，
申请(专利权)人：浙江德清汇宁生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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