改良型腈水合酶制造技术

通过野生型腈水合酶的改良，提供耐热性、酰胺化合物耐性以及高温累积性进一步提高了的具有腈水合酶活性的蛋白质。使用一种蛋白质，其为以下的(A)或(B)的蛋白质；(A)蛋白质，其特征在于，包含在野生型腈水合酶的氨基酸序列中特定的氨基酸残基被置换为其他的氨基酸残基而成的氨基酸序列，并且具有腈水合酶活性；(B)蛋白质，其特征在于，包含在上述(A)的蛋白质的氨基酸序列中除了上述特定的氨基酸残基之外缺失、置换和/或附加有1个或数个氨基酸残基而成的氨基酸序列，并且具有腈水合酶活性。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】改良型腈水合酶
本专利技术涉及改良型(变异型)的腈水合酶及其制造方法。进而涉及编码该酶的基因DNA、包含该基因DNA的重组载体、和具有该重组载体的转化体以及酰胺化合物的制造方法。
技术介绍
近年发现了酶腈水合酶、即具有将腈基水合并转换为酰胺基的腈水合活性的酶，公开了使用该酶或含有该酶的微生物菌体等通过腈化合物而制造对应的酰胺化合物的方法。已知该制造方法与现有的化学合成法相比较，由腈化合物向对应的酰胺化合物的转化率和选择率高。作为生产腈水合酶的微生物，可列举出例如：属于棒状杆菌属(Corynebacterium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、红球菌属(Rhodococcus)、根瘤菌属(Rhizobium)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、假诺卡氏菌属(Pseudonocardia)等的微生物。其中，玫瑰色红球菌(Rhodococcusrhodochrous)J1株用于丙烯酰胺的工业生产中，其有用性已被证实。另外，编码该菌株所产生的腈水合酶的基因也已明确(参照专利文献1)。另一方面，不仅利用由自然界中存在的微生物分离的腈水合酶、其基因，还出于改变腈水合酶的活性、底物特异性、Vmax、Km、热稳定性、对底物的稳定性、对生成物的稳定性等目的，尝试了向腈水合酶中导入变异(参照专利文献2)，本专利技术人等取得了使耐热性或酰胺化合物耐性均提高了的腈水合酶基因(参照专利文献3和4)。但是，从催化剂成本等生产成本的观点出发，开发耐热性和酰胺化合物耐性更进一步提高、或在高温下能够反应的腈水合酶并用于酰胺化合物的制造是非常有用的；从反应时的酶量的削减和成本削减等观点出发，期望开发而获得具有这样的性能的酶。现有技术文献专利文献专利文献1：日本专利第3162091号公报专利文献2：国际公开第2004/056990号小册子专利文献3：国际公开第2005/116206号小册子专利文献4：日本特开2007-143409号公报
技术实现思路
专利技术要解决的问题因此，本专利技术的目的在于通过腈水合酶的改良，提供耐热性、酰胺化合物耐性以及高温累积性进一步提高了的具有腈水合酶活性的蛋白质。另外，本专利技术的目的在于提供编码该蛋白质的基因DNA、包含该基因DNA的重组载体、包含该重组载体的转化体、从该转化体的培养物中提取的腈水合酶及其制造方法。进而，本专利技术的目的在于提供使用了该培养物或该培养物的处理物的酰胺化合物的制造方法。用于解决问题的方案本专利技术人等为了解决上述问题进行了深入的研究。结果发现，在野生型腈水合酶的氨基酸序列中将特定的氨基酸残基置换为其他的氨基酸残基而成的蛋白质不仅具有腈水合酶活性，耐热性、酰胺化合物耐性和高温累积性也提高了，至此完成本专利技术。即，本专利技术如下。(1)以下(A)或(B)的蛋白质；(A)蛋白质，其特征在于，包含在野生型腈水合酶的氨基酸序列中下述(a)、(b)、(c)、(d)和(e)的氨基酸残基被置换为其他的氨基酸残基、进而选自由下述(f)～(q)所组成的组的至少一个氨基酸残基被置换为其他的氨基酸残基而成的氨基酸序列，并且具有腈水合酶活性；(a)β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始数167残基下游的氨基酸残基、(b)β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始数219残基下游的氨基酸残基、(c)β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始数57残基下游的氨基酸残基、(d)β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始数114残基下游的氨基酸残基、(e)β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始数107残基下游的氨基酸残基、(f)β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始数218残基下游的氨基酸残基、(g)β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始数190残基下游的氨基酸残基、(h)β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始数168残基下游的氨基酸残基、(i)β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始数144残基下游的氨基酸残基、(j)β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始数133残基下游的氨基酸残基、(k)β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始数112残基下游的氨基酸残基、(l)β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始数105残基下游的氨基酸残基、(m)β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始数95残基下游的氨基酸残基、(n)β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始数17残基下游的氨基酸残基、(o)β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始数15残基下游的氨基酸残基、(p)α亚基的氨基酸序列中，由构成辅基结合区域的氨基酸序列C(S/T)LCSC的最下游侧的C残基起67残基下游的氨基酸残基、(q)α亚基的氨基酸序列中，由构成辅基结合区域的氨基酸序列C(S/T)LCSC的最下游侧的C残基起17残基下游的氨基酸残基、(B)蛋白质，其特征在于，包含在(A)蛋白质的氨基酸序列中除了前述置换后的氨基酸残基之外缺失、置换和/或附加有1个或数个氨基酸残基而成的氨基酸序列，并且具有腈水合酶活性。(2)一种DNA，其编码(1)所述的蛋白质。(3)一种重组载体，其包含(2)所述的基因DNA。(4)一种转化体，其包含(3)所述的重组载体。(5)一种腈水合酶，是从培养(4)所述的转化体而得到的培养物中提取的。(6)一种腈水合酶的制造方法，其特征在于，培养(4)所述的转化体，从得到的培养物中提取腈水合酶。(7)一种酰胺化合物的制造方法，其特征在于，使(1)所述的蛋白质或培养(4)所述的转化体而得到的培养物或该培养物的处理物与腈化合物接触。专利技术的效果本专利技术能够提供耐热性、酰胺化合物耐性和高温累积性提高了的新型的改良型(变异型)腈水合酶。耐热性、酰胺化合物耐性和高温累积性均进一步提高了的该改良型腈水合酶由于酰胺化合物的制造效率变高而非常有用。附图说明图1为质粒pER855A的结构图。图2-1为表示来源于各种微生物的野生型腈水合酶的β亚基的氨基酸序列的图。图2-2为表示来源于各种微生物的野生型腈水合酶的β亚基的氨基酸序列的图(接着图2-1)。图3-1为表示来源于各种微生物的野生型腈水合酶的α亚基的氨基酸序列的图。图3-2为表示来源于各种微生物的野生型腈水合酶的α亚基的氨基酸序列的图(接着图3-1)。具体实施方式以下，详细地说明本专利技术。需要说明的是，本说明书中，除了特别表明的情况，“上游”和“上游侧”在涉及氨基酸序列时意味着“N末端侧”，在涉及碱基序列时意味着“5’末端侧”。另外，“下游”和“下游侧”涉及氨基酸序列时意味着“C末端侧”，涉及碱基序列时意味着“3”。1.改良型腈水合酶(a)野生型腈水合酶本专利技术的改良型腈水合酶为野生型腈水合酶的改良型，对于其来源没有特别地限定。此处，“野生型腈水合酶”是指由自然界的生物(例如：土壤细菌等微生物)分离而得到的腈水合酶；意味着构成该酶的氨基酸序列、以及编码该酶的基因的碱基序列没有人为地缺失或插入，或者没有被其他的氨基酸或碱基置换而保持天然来源特性的状态的腈水合酶。另外，不仅是已知的微生物来源的腈水合酶，只由未限定生物来源的DNA序列限定的腈水合酶也包含于上述“野生型腈水合酶”中。“野生型腈水合酶”采取由α亚基和β亚基的结构域缔合而成的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种蛋白质，其为以下(A)或(B)的蛋白质；(A)蛋白质，其特征在于，包含在野生型腈水合酶的氨基酸序列中下述(a)、(b)、(c)、(d)和(e)的氨基酸残基被置换为其他的氨基酸残基、进而选自由下述(f)～(q)所组成的组的至少一个氨基酸残基被置换为其他的氨基酸残基而成的氨基酸序列，并且具有腈水合酶活性；(a)β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始数167残基下游的氨基酸残基、(b)β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始数219残基下游的氨基酸残基、(c)β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始数57残基下游的氨基酸残基、(d)β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始数114残基下游的氨基酸残基、(e)β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始数107残基下游的氨基酸残基、(f)β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始数218残基下游的氨基酸残基、(g)β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始数190残基下游的氨基酸残基、(h)β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始数168残基下游的氨基酸残基、(i)β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始数144残基下游的氨基酸残基、(j)β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始数133残基下游的 氨基酸残基、(k)β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始数112残基下游的氨基酸残基、(l)β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始数105残基下游的氨基酸残基、(m)β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始数95残基下游的氨基酸残基、(n)β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始数17残基下游的氨基酸残基、(o)β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始数15残基下游的氨基酸残基、(p)α亚基的氨基酸序列中，由构成辅基结合区域的氨基酸序列C(S/T)LCSC的最下游侧的C残基起67残基下游的氨基酸残基、(q)α亚基的氨基酸序列中，由构成辅基结合区域的氨基酸序列C(S/T)LCSC的最下游侧的C残基起17残基下游的氨基酸残基、(B)蛋白质，其特征在于，包含在(A)蛋白质的氨基酸序列中除了所述置换后的氨基酸残基之外缺失、置换和/或附加有1个或数个氨基酸残基而成的氨基酸序列，并且具有腈水合酶活性。...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.05.31 JP 2011-1212511.一种蛋白质，其为以下(A)的蛋白质；(A)蛋白质，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列为野生型腈水合酶的氨基酸序列的氨基酸残基被置换为如下所述其他的氨基酸残基而成的氨基酸序列，并且具有腈水合酶活性，所述野生型腈水合酶为来源于红球菌J1-H的腈水合酶，所述红球菌J1-H中α亚基的氨基酸序列为序列号4所示的氨基酸序列，β亚基的氨基酸序列为序列号2的所示氨基酸序列，被置换的氨基酸残基为下述氨基酸残基：(1)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(n)、和(i)的氨基酸残基和选自(p)或(p’)的氨基酸残基；(2)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(n)、(p)和(i)的氨基酸残基和选自(f)或(k)或(m)的氨基酸残基；(3)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(n)、(p)和(f)的氨基酸残基；(a)β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始数第167位残基的氨基酸残基置换为丝氨酸、(b)β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始数第219位残基的氨基酸残基置换为丙氨酸、(c)β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始数第57位残基的氨基酸残基置换为蛋氨酸、(d)β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始数第114位残基的氨基酸残基置换为酪氨酸、(e)β亚基的氨基酸序列中，由N末端的氨基酸残基开始...

【专利技术属性】
技术研发人员：渡边文昭，安保贵永，原爱，
申请(专利权)人：三菱丽阳株式会社，
类型：
国别省市：