改良型腈水合酶制造技术

本发明专利技术提供具有改良型腈水合酶活性的蛋白质，该蛋白质通过改变腈水合酶的氨基酸序列得到，与野生型腈水合酶活性相比耐热性提高；本发明专利技术还提供编码该蛋白质的基因DNA，具有该基因DNA的重组载体，具有该重组载体的转化体或转导体，提取自该转化体或转导体培养物的腈水合酶及其制备方法，以及酰胺化合物的制备方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及具有耐热性提高或底物特异性改变的改良型腈水合酶活性的蛋白质；编码该蛋白质的基因DNA ;具有该基因DNA的重组载体；具有该重组载体的转化体或转导体；提取自该转化体或转导体培养物的腈水合酶及其制备方法；以及使用了该培养物或该处理物的酰胺化合物的制备方法。
技术介绍
近年来，人们发现了具有腈水合活性的酶——腈水合酶，该酶可通过水合作用将腈基转换为酰胺基，并且公开了利用该酶或具有该酶的微生物菌体以腈化合物制备对应的酰胺化合物的方法。与以往的化学合成方法相比，这种制备方法因具有高度的由腈化合物转化成对应的酰胺化合物的转化率和选择率而为人所知。生产腈水合酶的微生物，可列举例如属于棒杆菌属(Corynebacterium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、红球菌属(Rhodococcus)、根瘤菌属(Rhizobium)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、假诺卡氏属(Pseudonocardia)等的微生物。其中玫瑰色红球菌(Rhodococcus rhodochrous) J-1株已用于丙烯酰胺的工业生产,其有效性已被证实。另外，编码生产该菌株的腈水合酶的基因也已查明(请参考专利文献I)。从降低反应时酶的用量和降低成本的观点出发，期待能获取耐热性进一步提高的酶。另一方面，不仅是利用从自然界存在的微生物离析得到的腈水合酶或其基因，出于改变腈水合酶的活性、底物特异性、Vmax, Km、热稳定性、底物稳定性、产物稳定性等目的，人们尝试对腈水合酶引入突变。(参考专利文献2和3)专利文献1:特许第3162091号公报专利文献2:国际公开2004/056990号手册(pamphlet)专利文献3:特开2004-222538号公报
技术实现思路
·腈水合酶是已用于丙烯酰胺工业生产的酶，但获取耐热性等性质较目前所使用的酶进一步提高的酶可降低酶反应时的成本。因此，本专利技术的目的在于进一步改良腈水合酶，提供耐热性更为提高的具有腈水合酶活性的蛋白质，编码该蛋白质的基因DNA，具有该基因DNA的重组载体，具有该重组载体的转化体或转导体，提取自该转化体或转导体培养物的腈水合酶及其制备方法以及使用了该培养物或处理物的酰胺化合物的制备方法。另外,玫瑰色红球菌(Rhodococcus rhodochrous) J-1株的腈水合酶虽然已用于以丙烯腈为原料的丙烯酰胺的工业生产，但对于芳香腈反应活性低，在期待开发出对于芳香腈反应活性高的酶的同时，从降低催化剂成本的观点出发，也期待开发出热稳定、不易失活的酶。因此，本专利技术以改良腈水合酶获得耐热性提高的酶以及/或者获得对芳香腈反应活性提高的酶为目的。本专利技术人为解决上述课题经过深入研究，发现在来源于玫瑰色红球菌(Rhodococcus rhodochrous) J-1株的腈水合酶的氨基酸序列中，通过将其中至少一个以上的氨基酸残基用选自天然氨基酸组的残基取代，该酶耐热性得以提高以及/或者对芳香腈的反应活性得以提高，从而完成了本专利技术。即，本专利技术如下所述: (I) 一种蛋白质，是野生型腈水合酶的β亚基的氨基酸序列上第93位谷氨酸残基被其他氨基酸残基取代并且具有耐热性腈水合酶活性的蛋白质，所述其他氨基酸残基是选自甘氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸以及酪氨酸中的任意一个氨基酸残基，所述野生型腈水合酶的β亚基的氨基酸序列如SEDIDNO:2所示。(2)上述(I)中所述的蛋白质，进一步地，β亚基的第103位谷氨酸残基被天冬氨酸残基取代。(3)上述(I)中所述的蛋白质，进一步地，野生型腈水合酶的α亚基的氨基酸序列上，第132位天冬氨酸残基被天冬酰胺残基取代，所述野生型腈水合酶的α亚基的氨基酸序列如SED ID NO -A所示。(4) 一种DNA，编码上述⑴-⑶中任意一项所述的蛋白质。(5) 一种重组载体，含有上述⑷所述的DNA。(6) 一种转化体，含有上述(5)所述的重组载体。(7) 一种制备腈水合酶的方法，其特征在于，培养上述(6)所述的转化体，从所得培养物提取腈水合酶。(8) 一种制备酰胺化合物的方法，培养上述(6)所述的转化体，使所得的培养物或该处理物与腈基化合物接触，提取通过该接触生成的酰胺化合物。本专利技术提供与野生型腈水合酶相比耐热性提高以及/或者对于芳香腈反应活性提高的突变型腈水合酶以及编码该酶的基因。本专利技术进一步提供具有上述突变型腈水合酶基因的重组DNA，具有该重组DNA的转化(转导)体，使用该转化(转导)体制备酰胺化合物的方法。通过本专利技术，可以高效制备丙烯酰胺。附图说明图1为质粒pJH601的组成图。图2为质粒p3R的组成图。图3为质粒pMH301的组成图。图4为质粒p52的组成图。图5A为质粒pCF002的组成图。图5B为质粒pFY529的组成图。具体实施例方式以下详细说明本专利技术。本说明书中所引用的文献、公开公报、国际公开公报等其他专利公报作为参照并入本说明书。<腈水合酶>本专利技术通过使野生型腈水合酶的氨基酸序列部分突变，提供与野生型腈水合酶相比耐热性和/或底物特异性提高的改良型腈水合酶。“腈水合酶”是催化腈化合物转化为对应酰胺化合物的水合反应(RCN+H20 - RCONH2)的酶。另外，“腈水合酶”的结构是由α亚基与β亚基聚合形成的高级结构。“野生型腈水合酶”指具有来源于作为酶源的微生物的野生株(亲株)的氨基酸序列的腈水合酶以及来源于野生株(亲株)的基因序列编码所得的腈水合酶。“野生型β亚基”或“野生型α亚基”指具有来源于野生株(亲株)的氨基酸序列的β亚基或α亚基以及来源于野生株(亲株)的基因序列编码所得的β亚基或α亚基。“野生型腈水合酶”可列举来源于各种微生物野生型的腈水合酶。微生物不仅限于具有编码腈水合酶的基因的微生物。优选具有来源于红球菌属微生物的氨基酸序列的腈水合酶以及来源于红球菌属微生物的基因序列编码所得的腈水合酶，所述红球菌属微生物例如可列举玫瑰色红球菌(Rhodococcus rhodochrous) J-1 (FERM BP-1478)、玫瑰色红球菌(Rhodococcus rhodochrous) M8 (SU1731814)、玫瑰色红球菌(Rhodococcus rhodochrous)M3 3 (VKM Ac_1515D)或玫瑰色红球菌(Rhodococcus rhodochrous) ATCC39484 (特开平2001-292772)等。或者是来源于史密氏杆菌(Bacillus smithii)(特开平09-248188)的腈水合酶亦可。特别优选的是具有来源于玫瑰色红球菌(Rhodococcus rhodochrous) J-1或玫瑰色红球菌(Rhodococcus rhodochrous)M8的氨基酸序列的腈水合酶以及来源于这两株的基因序列编码所得的腈水合酶。另外，玫瑰色红球菌(Rhodococcus rhodochrous)M33 (VKM Ac-1515D)菌是由M8 (SU1731814)菌通过自然突变产生的作为腈水合酶表达株而被筛选出的菌株。该菌株的腈水合酶本身的氨基酸序列和基因序列没有突变(美国专利第5827699 号)。在此，耐热性提高指来源于突变株的加热处理后的酶的残留活性本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种蛋白质，是野生型腈水合酶的β亚基的氨基酸序列上第93位谷氨酸残基被其他氨基酸残基取代并且具有耐热性腈水合酶活性的蛋白质，所述其他氨基酸残基是选自甘氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸以及酪氨酸中的任意一个氨基酸残基，所述野生型腈水合酶的β亚基的氨基酸序列如SED?ID?NO：2所示。

【技术特征摘要】
2004.05.26 JP 2004-156593;2004.08.18 JP 2004-23781.一种蛋白质，是野生型腈水合酶的β亚基的氨基酸序列上第93位谷氨酸残基被其他氨基酸残基取代并且具有耐热性腈水合酶活性的蛋白质， 所述其他氨基酸残基是选自甘氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸以及酪氨酸中的任意一个氨基酸残基， 所述野生型腈水合酶的β亚基的氨基酸序列如SED ID Ν0:2所示。2.如权利要求1所述的蛋白质，进一步地，β亚基的第103位谷...

【专利技术属性】
技术研发人员：渡边文昭，氏原大，酒井美纪，汤不二夫，中村哲二，
申请(专利权)人：DiaNitrix株式会社，
类型：发明
国别省市：