本文公开了一种硫酸软骨素酶B融合蛋白、其编码基因以及其构建方法。本文提供的硫酸软骨素酶B融合蛋白包括麦芽糖结合蛋白。此外本文还提供了一种纯化硫酸软骨素酶B融合蛋白的方法。另外，本文还涉及一种生产低分子量硫酸软骨素B的方法。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程和发酵工程领域中一种硫酸软骨素酶B融合蛋白及其编码基因以及其构建方法。此外本文还提供一种纯化硫酸软骨素酶B融合蛋白的方法。另外，本文还涉及一种生产低分子量硫酸软骨素B的方法。
技术介绍
硫酸软骨素裂解酶(chondroitinase或 chondroitin sulfaeyase,以下有时也简称为“ChSase”)是一类能将硫酸软骨素、软骨素、透明质酸等糖胺聚糖降解为不饱和二糖(ADi及寡糖的裂解酶。近年来,ChSase作为一种研究机体蛋白聚糖的结构与功能的工具以及作为一种新型药用酶而日益受到人们的重视。硫酸软骨素酶B(以下有时也简称为“ChSase B”)可特异性降解硫酸皮肤素及透明质酸为AD1-Os及寡糖。因ChSase B仅特异性降解硫酸皮肤素(也称为硫酸软骨素B)及透明质酸，所以对该酶的药用价值的研究比较另一种硫酸软骨素酶AC(以下有时也简称为“ChSase AC”)要少一些，但随着研究的深入，发现ChSase B也有着不可忽视的应用价值:在基础理论方面，利用ChSase B可特异性的降解硫酸软骨素蛋白聚糖中硫酸软骨素侧链，许多科研人员通过对机体组织特定部位的硫酸软骨素的降解，并通过该部位硫酸软骨素降解前后功能的改变及降解产物的分析，来了解硫酸软骨素的结果与功能(参见:Shibata S，MiduraRJ, Hascall UC.Structural analysis of the linkage region oligosaccharides andunsaturated disaccharides from chondroitin sulfate using Carbopac PA.J BiolChem，1992，267(10):6548-6555)。在临床运用领域，近年来研究非常活跃，研究表明，硫酸软骨素糖胺聚糖与肿瘤细胞的侵入、转移密切相关(参见:Henke CA, Roongta V,Mickelson DJ, et al.CD44_relatedchondroitin sulfat e proteoglycan,a cell surface receptor implicated with tumorcell invasion, mediates endothelial cell migration on fibrinogen and invasioninto a fibrin matrix.J Clin Invest,1996,97 (11):2541-2552)。2001 年Denholm EM等发现ChSase B能抑制黑色素瘤血管的形成及瘤细胞的转移与增生等(参见=Denholm EM,Lin YQ,Silver PJ.Ant1-tumor activities of chondroitinase AC and chondroitinaseB:inhibition of angiogenesis, proliferation and invasion.Eur J Pharmacol,2001,416(3):213-221)。在制药领域，硫酸软骨素是一种具有较强的降血脂作用和缓冲抗凝血作用的物质，临床上主要用于防止冠心病和动脉粥样硬化。目前，对低分子量硫酸软骨素的制备常采用酸水解法、离子交换法和酶解法。前两种方法需要较复杂的实验设备并且会污染环境，比较而言，酶解法需要的条件不高且容易控制，因而具备较大的优势。酶解法的关键在于获得大量的硫酸软骨素裂解酶，其中包括ChSase B的获得。硫酸软骨素裂解酶分离纯化非常复杂，通常需要经过多步的色谱纯化，收率很低。在分离纯化硫酸软骨素裂解酶中，ChSase B的异源重组表达是替代利用微生物生产ChSase B的可行的方案。然而对ChSase B的异源重组表达研究非常有限，到目前为止国内还没有这方面的报道。只有Pojasek等在E.coil中表达了 chsase基因，并分离纯化到活性蛋白，在其研究中所用的载体为pET15b和PCRT7/NT，这两个载体中的融合标签均His-tag。但His-tag存在明显的缺点，即跟亲和载体的亲和力不强,不能增加与之结合蛋白质的可溶性，难以提高纯化效果和蛋白质可溶性比例等。Pojasek的论文中关于His-tag的纯化效果和蛋白可溶性比例等内容均未给出清晰的报道(参见Kevin Pojasek,ZacharyShriver, Patrick Kiley，Ganesh Venkataraman and Ram Sasisekharan.RecombinantExpression, Purification and Kinetic Characterization of Chondroitinase ACand Chondroitinase B from Flavobacterium hparinum.Biochemical and BiophysicalResearch Communications，2001，286:343-351)。目前，需要一种简单、方便的方法，通过该方法可以得到具有硫酸软骨素酶B活性的硫酸软骨素酶B替代物，该替代物可以与硫酸软骨素酶B相同地使用。
技术实现思路
本专利技术人意外地得到了硫酸软骨素裂解酶替代物-硫酸软骨素酶B融合蛋白，其具有硫酸软骨素酶B的活性，能够用于生产硫酸软骨素，并且硫酸软骨素的生成条件不高、方法简便且容易控制。本文涉及以下内容:(I).一种硫酸软骨素酶B融合蛋白，其中融合有硫酸软骨素酶B和麦芽糖结合蛋白。(2).根据(I)所述的硫酸软骨素酶B融合蛋白，其中所述硫酸软骨素酶B具有SEQID NO:1所示的氨基酸。(3).根据(I)或(2)所`述的硫酸软骨素酶B融合蛋白，其中所述麦芽糖结合蛋白具有SEQ ID NO: 2所示的氨基酸(4).根据(I) (3)中任一项所述的硫酸软骨素酶B融合蛋白，其中，所述麦芽糖结合蛋白通过肽段连接部分与所述硫酸软骨素酶B连接。(5).根据(4)所述的硫酸软骨素酶B融合蛋白，其中，所述连接部分具有SEQ IDNO: 3所示的序列。(6).根据(4)所述的硫酸软骨素B融合蛋白，其中所述连接部分连接在SEQ IDNO:1的氨基酸的N端。(7).根据(I) (6)中任一项所述的硫酸软骨素融合蛋白B，其中所述融合蛋白具有SEQ ID NO:4所示的氨基酸。(8).一种硫酸软骨素酶B的替代物，其是(I) (7)中任一项所述的硫酸软骨素酶B融合蛋白。(9).一种编码(I) (7)中任一项所述的融合蛋白的DNA。(10).—种具有序列表中SEQ ID NO:5所不的喊基序列的DNA。(11).一种重组载体，其包含(9)或(10)所述的DNA。(12).一种转化体，其是将(11)所述的重组载体导入宿主细胞而得到的转化体。(13).一种构建(I) (7)中任一项所述的硫酸软骨素酶B融合蛋白的方法，包括(i).提供含麦芽糖结合蛋白的质粒载体；和(ii).将硫酸软骨素酶B的基因连接到上述质粒载体上。(14).根据(13)的方法，其中所述硫酸软骨素酶B的N端与通过肽段连接部分与麦芽糖结合蛋白结合。(15).一种纯化硫酸软骨素酶B融合本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种硫酸软骨素酶B融合蛋白，其中融合有硫酸软骨素酶B和麦芽糖结合蛋白。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：吴敬君，李晔，邢新会，张翀，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：北京;11
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