骨保护素变异蛋白制造技术

本发明专利技术涉及新的骨保护素变异蛋白(OVP)，与野生型骨保护素相比，其显示出减小的与其配体TRAIL的结合亲和力。还提供了编码这些OVP的核酸。还涵盖了表达这些OVP的重组载体和宿主细胞以及生产重组OVP的方法。本发明专利技术还涉及包含这些OVP的组合物，以及涉及治疗以增加骨转换和/或骨丢失为特征的骨疾病的方法。本发明专利技术的OVP对于防止骨再吸收很有用，并且可以用于治疗任何导致不正常骨转换或骨丢失的病症，例如骨质疏松症、高钙血症、骨佩吉特病、多发性骨髓瘤、骨癌和由类风湿性关节炎或骨髓炎所致的骨丢失等。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及在调节通过RANK和RANKL的相互作用介导的生物学作用中很有用的进化蛋白。更具体地，本专利技术涉及新的骨保护素变异蛋白，其与野生型骨保护素相比，具有改变的结合特异性。还提供了编码这些OVP的核酸。还涵盖表达这些OVP的重组载体和宿主细胞以及生产重组OVP的方法。本专利技术还涉及包含这些OVP的组合物，并且涉及治疗与通过RANK和RANKL的相互作用介导的生物学作用相关的疾病的方法。
技术介绍
Rank配体(RANKL) /0PG/RANK生物化学轴已被成功地用于治疗骨质疏松症、 类风湿性关节炎、癌诱导的骨组织破坏、转移、高韩血症和疼痛(Hofbauer et al., Cancer 92(3) p. 460-470 (2001)) 利用 0PG(Honore et al. , Nature Medicine 6(5) 521-528(2000))(针对 RANKL 的一种抗体)或者可溶性 RANK-Fc 蛋白(Oyajobi et al.， Cancer Res 61(6) :ρ· 2572-8 (2001))的治疗方法也正在开发中。OPG和可溶性RANK-Fc蛋白构建体与RANKL结合，由此减少了可以用于RANK受体活化的RANKL的量。除了在骨生物学中很重要之外，RANKL在免疫系统中通过调节抗原特异性T细胞应答起到重要的作用(Anderson et al. , Nature390 (6656) : 175-9 (1997)) oRANKL在活化的 T细胞上被高度表达，而RANK受体在成熟树状突细胞(DC)上以高水平进行表达。RANKL和 RANK之间的相互作用充当共刺激信号，其通过诱导DC分化、细胞因子产生和减少两种细胞型(DC细胞和T细胞)中的细胞凋亡来增强DC存活和T细胞增生。可通过利用RANK拮抗剂来阻断共刺激信号而获得用来产生对移植组织和/或器官的耐受性的免疫疗法。阻断共刺激阻止了 T细胞通过DC细胞的活化,而且使得同种异体反应性T细胞变得无细胞免疫反应性和 /或发生凋亡(Adler et al. , Current Opinion in Immunology 14:660-665(2002))。 通过类似的作用机制，拮抗性RANK信号转导可以是用于自身免疫和免疫介导的炎性失调如系统性红斑狼疮、发炎性肠道疾病、糖尿病、多发性硬化症、类风湿性关节炎和强直性脊柱炎。骨保护素(OPG)是肿瘤坏死因子(TNF)受体家族的一种蛋白，并且由Simonet等人首次描述(Cell, 89, 309-319 (1997))。在调节骨生成和转换的自然过程中，OPG似乎是一个关键的元件。已注意到在多种与异常骨代谢有关的疾病中的OPG和它的靶受体RANKL之间的平衡的变化。OPG已进行了临床前和临床试验，其具体在各种与增加的骨转换和骨丢失相关的疾病(包括骨质疏松症、风湿性关节炎、佩吉特病(Paget’ s disease)、牙周病、血管疾病和位于骨组织中或转移至骨组织的癌症)中应用的效力(对于评论，参见Lorenz et al.， J. Amer Med Assoc 292 =490-5(2004)以及其中的参考文献)。大量的OPG的动物试验在文献中已经报道过，与当前使用的用于减少骨丢失的其它疗法相比，表现出相同或者更优异的效果(Simonet et al.，Cell,89,309-319 (1997) ；Bolon et al. ,Cell Mol Life Sci 59， 1569-76(2002))。也已证实OPG能减轻与骨癌相关的疼痛(Luger et al. ,Cancer Research 61,4038-4047(2001))ο在US 6，015，938，US 6，284，740，US 6，284，728，US 6，613，544，US6, 316，408，US 6，288，032和US 6，369，027中详细地描述了 0PG。在US 6，087, 555中描述了缺少OPG表达的转基因小鼠。OPG在多发性骨髓瘤病人和骨质疏松症病人中对于减少骨转换已经进行了 I期试验。在患有骨质疏松症的绝经后女性的开始I/II期试验中，发现单次注射OPG就可以抑制 30-80% 的骨转换的标记物数天(Bekker et al. , J. Bone Miner Res 16，348-360 (2001))。 用一定范围的OPG剂量来治疗多发性骨髓瘤病人，并且显示高达50%的病人在30或者更多天内减少骨吸收(Body et al.，Cancer 97，887-892 (2003))。因此，临床前研究和临床研究都有非常强大的证据表明，OPG在各种以异常骨代谢为特征的病症中可能是一种高度有效的疗法。细胞因子的肿瘤坏死因子(TNF)家族和它们的相应受体包括相当多的成员，并且在配体-受体相互作用中在这些成员之间存在实质上的交叉反应性(对于评论，参见 Igney, F. H. and Krammer, P. HNature Reviews Cancer 2, 277-288 (2002))。TNF受体通常引发两种应答中的一种，或者是凋亡(程序性细胞死亡)应答或者是通过活化转录因子NF K B 的对细胞代谢途径的作用。该受体家族还包括充当假目标(decoy)的成员，以减弱在其它家族配体-受体对之间的相互作用的有效性。OPG看起来属于这一类的受体。与许多TNF受体家族成员相比，OPG在其目标特异性方面是相对受限制的。根据现有的知识，OPG只结合两种TNF类配体。I. RANKL (NF κ B配体的受体活化剂)，一种TNF类细胞表面分子，通常与TNF受体家族成员RANK相互作用，而RANK在破骨细胞前体、树突状细胞、T细胞和造血细胞前体上表达(Kong et al. , Nature 397:315-323(1999))。RANKL 与 RANK 在细胞表面上相互作用以刺激破骨细胞的生成和活性，而破骨细胞是骨转换中涉及的主要细胞(Hsu，H et al. ,Proc Natl Acad Sci USA 96,3540-3545(1999))。RANK 在基质细胞 / 成骨细胞上表达(Kong et al.，Nature397 :315-323 (1999))。OPG 和 RANKL 的相互作用抑制 RANKL 结合 RANK 和刺激破骨细胞的能力，并且正是OPG的这种活性赋予其减少骨丢失的能力(Lacey et al.， Amer J Pathol 157，435-448 (2000) ；Simonet et al.，Cell, 89, 309-319 (1997))。结合于 RANKL 的二聚 OPG 的结合常数已被报道为 6. 7nM (Wi I lard et al. ,Protein Expr. Purif 20， 48-57 (2000))，而其它的报道将结合常数置于2nM和IOnM之间。2. TRAIL(TNF相关的凋亡诱导配体)，一种TNF类细胞表面分子，涉及诱导癌细胞中的细胞凋亡。OPG被认为是少数用于TRAIL的假目标受体中的一种，用来调节其靶向癌细胞的能力(在上面参考的Igney a本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种与野生型OPG相比包括至少一个修饰的OPG变异蛋白，其中，与野生型OPG相比，所述OPG变异蛋白保持对于RANKL的结合亲和力，但是表现出减小的对于TRAIL的结合亲和力。

【技术特征摘要】
2004.12.13 US 60/635,7221.一种与野生型OPG相比包括至少一个修饰的OPG变异蛋白，其中，与野生型OPG相t匕，所述OPG变异蛋白保持对于RANKL的结合亲和力，但是表现出减小的对于TRAIL的结合亲和力。2.根据权利要求I所述的OPG变异蛋白，其包括在由氨基酸残基102-130包围的区域中的至少一个修饰。3.根据权利要求2所述的OPG变异蛋白，其包括在残基位置102、111、115、122、128或130处的至少一个氨基酸替代。4.根据权利要求2所述的OPG变异蛋白，其包括在包含残基107-118的环结构中的至少一个修饰。5.根据权利要求4所述的OPG变异蛋白，其包括在位置115处的修饰。6.根据权利要求5所述的OPG变异蛋白，其中，在位置115处的Ile被Thr、Met、Val、Asp、Gly、Ser 或 Arg 替代。7.根据权利要求2所述的OPG变异蛋白，其包括在残基122处的修饰。8.根据权利要求7所述的OPG变异蛋白，其中，在位置122处的Arg被Gly、Gin、Ser,Asn或Glu替代。9.根据权利要求2所述的OPG变异蛋白，其包括在位置128处的修饰。10.根据权利要求9所述的OPG变异蛋白，其中，在位置128处的Phe被Val、Ala、Leu、Ile或Ser替代。11.根据权利要求2所述的OPG变异蛋白，其包括在残基130处的修饰。12.根据权利要求11所述的OPG变异蛋白，其中，在位置130处的Val被Glu或Ala替代。13.根据权利要求I至12中任一项所述的OPG变异蛋白，其包括至少两个修饰。14.根据权利要求13所述的OPG变异蛋白，其包括在由残基122-130包围的区域中的至少两个修饰。15.根据权利要求14所述的OPG变异蛋白，其包括选自由以下构成的组中的至少两个修饰(i)R122N和 I115M ；(ii)R122N和I115M ；(iii)F128S和I115M ；(iv)F128I和 I115M ;和(v)F128L和 I115M。16.根据权利要求13所述的OPG变异蛋白，其包括在由残基122-130包围的区域中的至少一个修饰和在这个区域外的至少一个另外的修饰。17.根据权利要求16所述的OPG变异蛋白，其中，所述另外的修饰发生在残基31、40、51、100、155、167或168中的任何一个或多个上。18.根据权利要求16所述的OPG变异蛋白，其中，所述另外的修饰发生在残基Gln21、Glu22、Thr23、Phe24、Pro25、Pro26、Lys27、Tyr28、Leu29、His30、Tyr31、Asp32、Glu33、Glu34、Thr35、Ser36、His37、Gln38、Asp42、Lys43、Pro45、Pro46、Thr48、Lys5U Gln52、His53、Cys54、Thr55、Ala56、Lys57、Trp58、Lys59、Thr60、Val61、Ala63、Pro64、Pro66、Asp67、His68、Tyr69、Asp72、Ser73、Trp74、Thr76、Ser77、Asp78、Glu79、Leu81、Tyr82、Ser84、Pro85、Val86、Lys88、Glu89、Leu90、Tyr92、Val93、Lys94、Gln95、Glu96、Asn98、Arg99、Thrl00、Hisl01、Vall31、Glnl32、Alal33、Glyl34、Thrl35、Prol36、Glul37、Argl38、Vall41、Lysl43、Argl44、Cysl45、Prol46、Aspl47、Glyl48、Phel49、Phel50、Serl51、Asnl52、Glul53、Thrl54、Serl55、Se...

【专利技术属性】
技术研发人员：安东尼·罗伯茨，乔治·科普西达斯，格雷戈里·科亚，梅里琳·斯莱，文森特·巴托里，
申请(专利权)人：赛弗隆澳大利亚VIC私人有限公司，
类型：发明
国别省市：