新的人生长因子变异剪接体蛋白及其编码序列制造技术

本发明专利技术提供了一种在人体正常脑垂体组织中表达的新的生长因子变异剪接体－即ＧＨ－Ｖ蛋白及其编码序列，本发明专利技术还提供了该蛋白和核酸序列的制备方法，以及在样品中检测人ＧＨ－Ｖ核酸序列和多肽的方法。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及内分泌学、基因工程学、进化遗传学领域。具体地，本专利技术涉及一种在人类脑垂体中表达的新的生长因子变异剪接体-即GH-V蛋白，及其核酸序列。本专利技术还涉及该蛋白和核酸序列的制备方法和用途。生长激素(growth hormone，GH)是由脑垂体前部的嗜酸细胞合成的(Clin.Res.25461A，1977.)。正常的生长激素(GH)有217个氨基酸，上有四个生长激素、催乳激素以及相关激素的蛋白功能片段35-61位，79-116位，135-151位，186-209位。1980年Owerbach等人通过体细胞杂交和限制性内切酶作图找到了第二个生长激素，命名为生长促乳素(chorionic somatomammotropin，CSH)。后来发现有3个以上的CSH和2个以上的GH。这些基因的同源度很高，而且其插入片段也相一致(Science209289-292，1980.)。后来，Baxter找到证据证实了在17号染色体上至少有3个GH和3个胎盘动物催乳激素(PL)的基因。人类的PL与GH的同源度比鼠的GH与人的GH的同源度还要高，而且事实上PL的产乳功能远没有其促生长效果明显。可以推测PL与GH分化自共同祖先基因。Lebo，George和Ruddle等人先后发现，GH家族都是在17号染色体上离着丝粒不远的半乳糖激酶和胸苷激酶之间。(Hum.Genet.57138-141，1981.)后来又有多种GH的异形体被发现。Masuda等人通过cDNA分子克隆发现20kdGH-V也是由GH基因编码的，只是其中牵涉到变异剪接(Biochim.Biophys.Acta 949125-131，1988.)。1997年Boguszewski等人在肢端肥大征患者群中研究了22kd以外的GH异形体在全部此类激素中所占的比例，发现在同一个体的各个样本中都相当恒定，不论GH水平如何(J.Clin.Endocr.Metab.821516-1521，1997.)。Boguszewski等人又调查了一批青春期前矮个的儿童，研究其中的22kd以外的GH异形体的水平，以期找出病因。结果发现，22kd以外的GH异形体在正常的生长发育和异常的生长发育中都起了极大的作用(J.Clin.Endocrinol.Metab.822944-2949，1997.)。研究已暗示，生长因子的异常与一些疾病相关，因此，为治疗目的研究和开发人生长因子或其变异剪接体有重要意义。然而在本专利技术被公布之前，尚未有任何公开或报道过本方面所涉及的人GH-V蛋白序列以及编码它的核酸序列。本专利技术的第一目的就是提供一种新的人生长因子变异剪接体-即人GH-V基因(Genbank Accession No.AF185611)，该基因编码一种新的人生长因子变异剪接体-GH-V蛋白。本专利技术的第二目的是提供一种新的人蛋白GH-V。本专利技术的第三目的是提供一种利用重组技术生产上述的新的人GH-V蛋白和核酸序列的方法。本专利技术还提供了这种人GH-V蛋白多肽和编码序列的应用。在本专利技术的一个方面，提供了一种分离出的DNA分子，该分子包括编码具有人GH-V蛋白质活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.6中从核苷酸第19-555位DNA分子的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度严紧条件下与SEQ ID NO.6中从核苷酸第19-555位的核苷酸序列杂交。较佳地，所述的序列编码具有SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列的多肽。更佳地，所述的序列具有SEQ ID NO.6中从核苷酸第19-555位的核苷酸序列。在本专利技术的另一方面，提供了一种分离出的人GH-V蛋白质多肽，它包括具有SEQ ID NO.7氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。较佳地，该多肽是具有SEQ ID NO.7序列的多肽。在本专利技术的另一方面，还提供了一种载体，它包含上述的DNA分子。在本专利技术的另一方面，还提供了一种用上述载体转化的宿主细胞。在一个实例中该宿主细胞是大肠杆菌；在另一实例中，该宿主细胞是真核细胞。在本专利技术的另一方面，还提供了一种产生具有人GH-V蛋白质活性的多肽的方法，该方法包括(1)将编码具有人GH-V蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成人GH-V蛋白表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.6中从核苷酸第19-555位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(2)将步骤(1)中的表达载体转入宿主细胞，形成人GH-V蛋白的重组细胞；(3)在适合表达人GH-V蛋白多肽的条件下，培养步骤(2)中的重组细胞；(4)分离出具有人GH-V蛋白活性的多肽。较佳地，在该方法中使用的核酸序列具有SEQ ID NO.6中第19-555位的序列。本专利技术还提供了与GH-V蛋白多肽特异性结合的抗体。在本专利技术中，“分离的”、“纯化的”或“基本纯的”DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组份分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。在本专利技术中，术语“人GH-V蛋白(或多肽)编码序列”指编码具有人GH-V蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.6中第19-555位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO.6序列的编码框第19-555位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO.6中第19-555位核苷酸序列同源性低至约70％的简并序列也能编码出SEQ ID NO.7所述的序列。该术语还包括能在中度严紧条件下，更佳的在高度严紧条件下与SEQ ID NO.6中从核苷酸第19-555位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。该术语还包括与SEQID NO.6中从核苷酸第19-555位的核苷酸序列的同源性至少70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％，最佳地至少95％的核苷酸序列。该术语还包括能编码具有与天然的人GH-V相同功能的蛋白的、SEQ ID NO.6中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。在本专利技术中，“基本纯的”蛋白质或多肽是指其至少占样品总物质的至少20％，较佳地至少50％，更佳地至少80％，最佳地至少90％(按干重或湿重计)。纯度可以用任何合适的方法进行测量，如用柱层析、PAGE或HPLC法测量多肽的纯度。基本纯的多肽基本上不含天然状态下的伴随其的组分。在本专利技术中，术语“人GH-V蛋白或多肽”指具有人GH-V蛋白活性的SEQ IDNO.7序列的多肽。该术语还包括具有与天然人GH-V相同功能的、SEQ ID NO.7序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离出的ＤＮＡ分子，其特征在于，它包括：编码具有人ＧＨ－Ｖ蛋白质活性的多肽的核苷酸序列，而且 所述的核苷酸序列与ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６中从核苷酸第１９－５５５位的核苷酸序列有至少７０％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度严紧条件下与ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６中从核苷酸第１９－５５５位的核苷酸序列杂交。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：宋怀东，彭永德，李能干，韩泽广，陈竺，
申请(专利权)人：国家人类基因组南方研究中心，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]