一种在使用色谱的纯化顺序中纯化生长因子蛋白的方法，特征在于：-至少一种色谱用多元树脂进行；-所述生长因子蛋白在pH?4到6.2之间时结合至所述多元树脂，并且所述生长因子蛋白在pH＞6.3下洗脱，并且生长因子蛋白的洗脱通过向洗脱缓冲液加入精氨酸和/或NaCl来改进。-多元树脂步骤随后是酵母源性亲和配体树脂步骤，这导致产物纯度＞90%。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】本专利技术涉及使用色谱。从天然来源的原料中纯化蛋白是一种挑战，因为感兴趣的蛋白通常仅以痕量存在并伴随以其它生物聚合物例如脂质、蛋白或者甚至细胞片段。另外感兴趣的蛋白往往与生物学功能相关联，所述生物学功能经常在其纯化方法步骤中丧失。纯化生物聚合物例如蛋白质的方法的库是很大的。除了沉淀方法，基于多种材料的色谱方法也是已知的。所述材料常常用化学部分修饰，例如有机离子、阳离子例如质子化氨或部分或完全烷基化的氨。这样的材料用作阴离子交换剂。但是阳离子交换剂也可用于基于感兴趣的蛋白的物理特性的纯化方法，所述物理特性例如性状、分子量和尤其是其电荷。可选地或联合地使用亲和色谱法。本领域已知传统离子交换色谱树脂(例如SP-，CM-, Q-或DEAE琼脂糖FF离子交 换色谱树脂)的一个缺点是蛋白质与树脂的连接仅能在相对低盐浓度(电导率，渗透压浓度等)内，典型地在O. 01-0. 15M的盐(NaCl等)浓度范围内发生。在某些应用中存在能够利用相对温和的纯化条件的需求，其中离子交换色谱步骤施加于所述蛋白，并在有所增加的离子强度下直接(没有进一步稀释)施加至色谱树脂。增加的离子强度对蛋白溶液中的蛋白稳定性有显著优势；尤其在粗品蛋白制备中，像在收获重组制备的蛋白产物或在血浆源性产物中，其中潜在的蛋白酶存在于溶液中，其可以负向影响目标蛋白。由于蛋白酶经常在生理条件下最好地工作(像在大多细胞系统中的情况)，即大约PH 7和盐浓度为大约O. 15M。可以通过改变工作条件例如通过加入盐和/或改变pH来抑制蛋白酶，然而，这些参数都对传统的离子色谱步骤的性能是很重要的，并且从而经常不可能组合使用。需要提供这样的纯化方法，在所述方法的过程中可以使用使蛋白酶的影响最小化的条件。W0-A2-2008/073620公开了一种多肽生产方法，所述多肽在昆虫细胞中用杆状病毒表达系统生产。在一个实例中，所述昆虫细胞培养物在补充了脂质混合物之后立即感染(例如，一小时之后感染)。从所述昆虫细胞培养物中用这样的方法分离多肽在纯化过程的早期利用阴离子交换或混合式色谱。该方法步骤用于移除源自昆虫细胞的多糖内切酶和蛋白酶并从而减少期望多肽由于酶降解而带来的损失。在另一个实例中，将混合式色谱与染料配体亲和色谱以连续流方式组合以允许昆虫细胞培养物液体的快速处理和捕获多肽。在又一个实例中，用这样的方法从昆虫细胞培养物液体中分离多肽在制备基本上不含多糖内切酶和蛋白水解活性的多肽溶液的单一操作单元中将中空纤维过滤、混合式色谱和染料配体亲和组合。再进一步的实例中，所述分离的多肽是具有昆虫特定糖基化方式的糖肽，其任选地用糖基转移酶和修饰的核苷酸糖连接至修饰基团，例如聚合物(例如，PEG)。W0-A2-2009/063069公开了一种纯化肽的方法，特别地但不排他地，涉及从肽溶液中移除外毒素的方法，包含用于所述方法的反应物的试剂盒和通过所述方法获得的纯化的肽。Dasari Venkata Krishna Rao等人公开了一种纯化方法，其使用一种为促进rhG-CSF (重组人粒细胞克隆-刺激因子)的产量而发展的过程控制策略。在该研究中达到了 > 99%的纯度和2. 18g/l的总产量。纯化期间产物的分析表明去污剂移除了 72%的LPS(脂多糖)和98%的HCP (宿主细胞蛋白)而不移除核酸。半胱氨酸浓度是蛋白再折叠的关键参数。评估了 SEC (尺寸排阻色谱)柱中的基底高度和HETP (高度等效理论板)值并研究了其对拆分的效果。发现SEC期间的公式化对增加产物产量和节约时间和过程成本是至关重要的。Quan Bai等用强阴离子交换色谱(SAX)研究了在大肠杆菌中表达的重组人粒细胞巨噬细胞克隆刺激因子(rhGM-CSF)的纯化和复性。用SAX分别研究了流动相中pH值、GSH/GSSG的浓度比和尿素浓度对rhGM-CSF的纯化和复性的影响。结果显示上述三个因子对rhGM-CSF的复性效率和质量回收具有显著影响。流动相中加入GSH/GSSG能提高rhGM-CSF中正确的二硫键的形成从而增加其复性产量。另外，为了用SAX增加rhGM-CSF的质量回收，将低浓度的尿素加入流动相中以防止变性蛋白聚集。在优化条件下，仅通过一个步骤在30分钟内使rhGM-CSF复性同时在SAX柱上纯化。ShellyA. Pizarro报告了一种血管内皮生长因子(VEGF165),这是一种在体内诱导血管生成和血管渗透性有效的促细胞分裂原，并证明了对加速创伤愈合的治疗应用的潜力。该报告中描述的方法涉及能够生产大约9g的rh VEGF每升的培养基的细菌表达系统和蛋白质折叠和三个色谱步骤的下游纯化方法，之后为药物物质的制剂化。使用了高细胞密度(HCD)补料分批发酵方法以在原生质包含体中生产rhVEGF。从细胞溶解物中收获包含体并使之经历单一步骤的蛋白溶解和重折叠操作以提取rhVEGF用于纯化。在发展包括重折叠和色谱期间的全部回收收率为30±6%。在实验室和大尺度示范性方法中宿主细胞混杂物均被常规地清除至低于目标水平。重折叠和纯化的rhVEGF的结构通过质谱来确认。N-端测序、胰蛋白酶肽作图以及产物变体通过多重HPLC化验来分析。Kimberly A. Kaleas公开了混合式色谱树脂作为用于挑战给料的纯化工具越来越流行，并公开了用Capto MMC从碱性给料中选择性捕获重组人血管内皮生长因子(rhVEGF)工业化应用的发展。Capto MMC树脂包含这样的配体，其具有参与与蛋白的离子、疏水和氢键作用的潜力并与高交联琼脂糖珠基体偶联。VEGF是涉及血管生成的关键生长因子并具有对创伤愈合的治疗性应用。它在大肠杆菌中以包含体表达。从细胞溶解物中收获固体，溶解rhVEGF并在pH 9. 8下在尿素和氧化还原试剂存在下溶解和重折叠。Capto MMC的独特的混合模式特性使得能够以最小的负载条件捕获该碱性蛋白，并以>95%收率向下游过程传递浓缩池同时使宿主细胞蛋白含量降低至< 1.2%。该研究探索了负载条件和保留时间对动态结合容量的影响以及最佳纯化性能的洗脱条件的开发。在评价各种洗脱缓冲液之后，L-精氨酸HCl显示出可作为rhVEGF从Capto MMC解吸附的有效洗脱试剂，因为它成功中断了树脂和rhVEGF之间的多重相互作用。实验室尺度的成果产生了成功地以商业化制造尺度实施的坚固的色谱步骤。本专利技术的一个目的是通过提供新的方法来避免现有技术中生长因子蛋白的纯化方法的缺点。根据本专利技术，该目的通过以使用色谱的纯化顺序纯化选自以下的生长因子的方法来实现克隆刺激因子(CSF)例如G-CAF (粒细胞克隆刺激因子)或粒细胞-巨噬细胞CSF (GM-CSF)、白介素3 (IL-3)、肝细胞生长因子、表皮生长因子和成纤维细胞生长因子(酸性)，其中-至少一个色谱用多元树脂(multimodalresin)来进行-将所述生长因子蛋白在pH4-6. 2下结合至多元树脂，和-将所述生长因子蛋白在pH> 6. 3下从多元树脂上洗脱。本专利技术提供了这样的方法，其中蛋白酶的影响可以被便利地最小化。使得可以在潜在存在能够降解目标蛋白的蛋白酶的情况下在粗蛋白样品中添加盐和/或改变PH，并可以在没有任何进一步的测量的情况下处理蛋白溶液并将目本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：古斯塔夫·吉尔加姆，斯特凡·温厄，马亚·蒂迈尔，
申请(专利权)人：奥克塔法马股份有限公司，
类型：
国别省市：
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