一种固相合成GLP-1类似物的方法技术

本发明专利技术涉及多肽固相合成领域，为解决固相合成GLP-1类似物过程中氨基酸顺序连接困难或不完全造成而产生性质非常相似的缺失肽和副产品，导致后续纯化的时不能分离副产品的问题，本发明专利技术提出一种固相合成GLP-1类似物的方法，本发明专利技术在难连位点采用了片段缩合方法和引入取代基的方法，提高了多肽合成的收率。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及多肽固相合成领域，具体地说涉及一种固相合成GLP-I (胰高血糖素样肽-I)类似物的方法。
技术介绍
随着细胞和分子生物学的发展，肠促胰素这层神秘的面纱被慢慢揭开，研究证实， 肠促胰素是人体内一种肠源性激素，肠促胰素以葡萄糖浓度依赖性方式促进胰岛β细胞分泌胰岛素，并减少胰岛α细胞分泌胰高血糖素(glucagon)，从而降低血糖。正常人在进餐后，肠促胰素开始分泌，进而促进胰岛素分泌，以减少餐后血糖的波动。但对于2型糖尿病患者，其“肠促胰素效应”受损，主要表现为进餐后胰高血糖素样肽-I (GLP-I)浓度升高幅度较正常人有所减小，但其促进胰岛素分泌以及降血糖的作用并无明显受损，因此GLP-I 及其类似物可以作为2型糖尿病治疗的一个重要靶点。GLP-I主要通过以下几方面发挥降糖作用。GLP-I具有保护β细胞的作用GLP-I可作用于胰岛β细胞，促进胰岛素基因的转录、胰岛素的合成和分泌，并可刺激胰岛β细胞的增殖和分化，抑制胰岛β细胞凋亡，增加胰岛β细胞数量。此外，GLP-I还可作用于胰岛α细胞，强烈地抑制胰高血糖素的释放， 并作用于胰岛δ细胞，促进生长抑素的分泌，生长抑素又可作为旁分泌激素参与抑制胰高血糖素的分泌。研究证明，GLP-I可通过多种机制明显地改善2型糖尿病动物模型或患者的血糖情况，其中促进胰岛β细胞的再生和修复，增加胰岛β细胞数量的作用尤为显着， 这为2型糖尿病的治疗提供了一个非常好的前景。然而，要将GLP-I应用于临床也面临着问题，那就是人体自身产生的GLP-I极易被体内的二肽基肽酶IV (DPP-IV)降解，其血浆半衰期不足2分钟，必须持续静脉滴注或持续皮下注射才能产生疗效，这大大限制了 GLP-I的临床应用。为解决这一难题，学者们已经提出两种方案一是开发GLP-I类似物，让其既保有GLP-I的功效，又能抵抗降解二是开发DPP- IV抑制剂，使体内自身分泌的GLP-I不被降解，维持GLP-I的功效。目前市场上的GLP-I类似物通用名为艾塞那肽，英文名Exenatide，化学结构式 为His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-A Ia-Val-Arg-Leu-Phe-IIe-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2 ;分子式=C184H282N50O60S ;分子量4186. 61。传统的固相逐步合成法都是将一个一个保护氨基酸顺序偶联。但是，在多肽合成时往往有一些位点由于多肽长链的折叠和氨基酸的空间位置限制，往往使连接下一个氨基酸的反应难以进行或难以完全。在合成超过二十个氨基酸以后，特别是合成困难的多肽键时，产生以残基缺失为主的寡肽副产品含量显着增加并不断积累，由于这些寡肽副产品与目标肽在分子量、溶解性、极性和结构上很相似，难以纯化。申请号为200710044421.4的中国专利，公开了一种固相多肽合成EXENATIDE的制备方法，该专利技术提供了一种固相多肽合成EXENATIDE的制备方法以RINK AMIDE树脂、 RINKAMIDE AM树脂或RINK AMIDE MBHA树脂为起始原料，依次连接具有FMOC保护基团的氨基酸，获得保护的三十九肽树脂，其间依 次脱去FMOC-保护基团，用缩合剂，进行接肽反应，得保护的三十九肽树脂后，同步进行脱侧链保护基团及切肽，获得EXENATIDE粗品， 并经C18或CS柱进行分离纯化，再经冷冻干燥，获得产品。该专利技术的合成方法属于传统的一个一个保护氨基酸顺序偶联，没有解决由于连接困难或是连接不完全而产生性质非常相似的缺失肽等副反应，导致纯化困难等问题。
技术实现思路
为解决固相合成GLP-I类似物过程中氨基酸顺序连接困难或不完全造成而产生性质非常相似的缺失肽和副产品，导致后续纯化的时不能分离副产品的问题，本专利技术提出一种固相合成GLP-I类似物的方法，该方法在难连接点，采用片段缩合和引入取代基的方法，提高了多肽合成的收率。本专利技术是通过以下步骤实现的一种固相合成GLP-I类似物的方法，所述的合成方法为以下步骤(I)以Fmoc-Rink Amide PEG MBHA Resin作为起始的树脂，在溶剂DCM或DMF作用下在容器中溶胀；起始树脂Fmoc-Rink Amide PEG MBHA Resin 的取代度为 O. lmmol/g^O. Bmmol / g，作为优选，取代度为O. 40mmol/g。溶剂的使用量为使起始树脂全部浸在溶剂中的量，溶胀 O. 5^12小时。起始树脂的溶胀是反应试剂分子进入树脂内部与功能基反应的先决条件，在反应进行中固相载体的充分溶胀对反应试剂分子、可溶的构件分子的自由运动十分有利， 因而能达到充分反应的效果。(2)在容器中加入脱保护试剂后，然后对脱保护后的树脂进行冲洗备用；脱保护试剂选自Fmoc的脱保护试剂或者Boc的脱保护试剂，Fmoc的脱保护试剂选用体积浓度为20% 的哌啶/DMF溶液，Boc的脱保护试剂选自体积浓度为50%的TEA/DCM溶液，脱保护试剂的使用量为树脂体积的2飞倍。脱保护反应温度为5 50°C，脱保护反应时间为1(Γ30分钟。(3)以Fmoc或者Boc氨基保护的氨基酸或者肽片段溶液作为中间原料，在DMF溶剂中加入活化剂对羧基预活化；活化剂选自碳二亚胺型(DIC)、苯并三唑鎗盐型(Β0Ρ)、_ 啶并三唑鎗盐型(Α0Ρ)、磷酸酯型缩合试剂中一种，其中DIC与HoBt或者HoAt同时使用， BOP或者AOP与叔胺同时使用，目前，常规使用量为氨基酸或者肽片段溶液DIC =HoBt或者 HoAt的摩尔比为I :1 :1，氨基酸或者肽片段溶液B0P或者AOP :叔胺的摩尔比为1:1:1，磷酸酯型缩合试剂选自DPPA、DEPBT、FDPP中一种，活化剂的使用量与氨基酸及肽片段投料量的摩尔数相同，中间原料在冰浴中预活化5 15min，DMF溶剂的使用量为使溶质溶解的量， 常规为溶质与溶剂的质量体积比为Ig以能够完全溶解原料为宜,体积越小越好。(4)将活化后的Fmoc或者Boc保护的氨基酸或者肽片段溶液与步骤(2)得到的产物混合，进行缩合反应；保护氨基酸及肽片段的投料量与步骤(2)产物的摩尔比为2飞1。 缩合反应温度为5 50°C，缩合反应的时间为广3小时，如果反应不完全，可以延长反应时间或是换液重新偶联。将活化的Fmoc或者Boc保护氨基酸或者肽片段与经溶胀、脱氨基保护的多肽固相树脂混合，则树脂上中间产物多肽的脱保护氨基与溶液中的带保护氨基酸的活化羧基间发生缩合反应，固相树脂上形成更长链的Fmoc或者Boc保护氨基的多肽片段。(5 )抽取步骤(4 )的产物通过茚三酮监测缩合反应完成的程度，直到步骤(4 )完成反应，然后对步骤(4)的产物进行冲洗；通过茚三酮监测缩合反应完成的完成程度，直到反应完成。经洗涤，得到了具有更长肽片段的Fmoc或者Boc保护氨基肽片段固相树脂。茚三酮监测步骤为茚三酮检测液A、B、C液各两滴，加热到11(T12(TC并保持l_2min，如果溶液有兰色，或固相树脂出现兰色，红褐色，表明还有游离氨基，反应尚未本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种固相合成GLP?1类似物的方法，其特征在于：所述的合成方法为以下步骤：（1）以Fmoc?Rink?Amide?PEG?MBHA?Resin作为起始树脂，在DCM或DMF溶剂下在容器中溶胀；?（2）在容器中加入脱保护试剂后，然后对脱保护后的树脂进行冲洗备用；（3）以Fmoc或者Boc氨基保护的氨基酸或者肽片段溶液作为中间原料，在DMF溶剂中加入活化剂对羧基预活化备用；（4）将活化后的Fmoc或者Boc保护的氨基酸或者肽片段溶液与步骤（2）得到的脱保护产物混合，进行缩合反应；（5）抽取步骤（4）的产物通过茚三酮监测缩合反应完成的程度，直到步骤（4）完成反应，然后对带有产物的固相树脂进行冲洗；（6）将步骤（5）的产物放入容器中，重复步骤（2）~（5），按照氨基酸序列从C端到N端的顺序进行新的氨基酸或者肽片段的缩合，最后，经过冲洗得到侧链全保护的GLP?1类似物?Rink?Amide?MBHA?PEG固相树脂；（7）对步骤（6）得到的侧链全保护的GLP?1类似物?Rink?Amide?MBHA?PEG?固相树脂进行脱保护和切割反应，然后采用冰乙醚沉淀、过滤得到GLP?1类似物粗产品；（8）得到的GLP?1类似物粗产品通过离子交换及反相高效液相色谱进行分离纯化，最后通过冷冻干燥，得到GLP?1类似物产品。...

【技术特征摘要】
1.一种固相合成GLP-I类似物的方法，其特征在于所述的合成方法为以下步骤 (1)以Fmoc-RinkAmide PEG MBHA Resin作为起始树脂，在DCM或DMF溶剂下在容器中溶胀； (2)在容器中加入脱保护试剂后，然后对脱保护后的树脂进行冲洗备用； (3)以Fmoc或者Boc氨基保护的氨基酸或者肽片段溶液作为中间原料，在DMF 溶剂中加入活化剂对羧基预活化备用； (4)将活化后的Fmoc或者Boc保护的氨基酸或者肽片段溶液与步骤(2)得到的脱保护产物混合，进行缩合反应； (5)抽取步骤(4)的产物通过茚三酮监测缩合反应完成的程度，直到步骤(4)完成反应，然后对带有产物的固相树脂进行冲洗； (6)将步骤(5)的产物放入容器中，重复步骤(2) (5)，按照氨基酸序列从C端到N端的顺序进行新的氨基酸或者肽片段的缩合，最后，经过冲洗得到侧链全保护的GLP-I类似物-Rink Amide MBHA PEG 固相树脂； (7)对步骤(6)得到的侧链全保护的GLP-I类似物-RinkAmide MBHA PEG固相树脂进行脱保护和切割反应，然后采用冰乙醚沉淀、过滤得到GLP-I类似物粗产品； (8)得到的GLP-I类似物粗产品通过离子交换及反相高效液相色谱进行分离纯化，最后通过冷冻干燥，得到GLP-I类似物产品。2.根据权利要求I所述的一种固相合成GLP-I类似物的方法，其特征在于，步骤(I)中起始树脂 Fmoc-Rink Amide PEG MBHA Resin 的取代度为 0. lmmol/g-0. 6mmol/g,溶剂的使用量为使起始树脂全部浸在溶剂中的量，溶胀0. 5^12小时。3.根据权利要求I所述的一种固相合成GLP-I类似物的方法，其特征在于，步骤(2)中脱保护试剂选自Fmoc的脱保护试剂或者Boc的脱保护试剂，Fmoc的脱保护试剂选用体积浓度为20%的哌啶/DMF溶液，BOC的脱保护试剂选自体积浓度为50% TEA/DCM，树脂与脱保护试剂的质量体积比为Ig :2 15ml，脱保护反应温度为5 ...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘秀丽，
申请(专利权)人：吉林省敖腾生物科技有限责任公司，
类型：发明
国别省市：