本发明专利技术提供了一种人源化鼠兔瘦素蛋白及编码该蛋白的基因，其核苷酸序列和氨基酸序列分别如SEQ?ID?No.1和SEQ?ID?No.2所示。本发明专利技术还提供了上述可溶性重组人源化鼠兔瘦素蛋白的表达及纯化方法。本发明专利技术建立了高糖高脂血症的动物模型，采用重组人源化鼠兔leptin蛋白和人leptin蛋白进行治疗，结果表明：与人leptin蛋白相似，人源化鼠兔leptin蛋白可明显降低血糖浓度及血清总胆固醇、甘油三酯水平；降低内脏白色脂肪组织含量及细胞内脂肪的堆积，促进肝脏中参与糖代谢和脂代谢的关键基因的表达量。与重组人leptin蛋白相比，人源化鼠兔leptin蛋白在改善血糖降低血脂的作用更为显著。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程领域，具体地说，涉及一种人源化鼠兔瘦素蛋白、编码该蛋白的基因及其应用。
技术介绍
青藏高原特有的动植物资源在世界上是独一无二的。高寒、低氧、强紫外线辐射的极端压力环境给这里的动植物的生存带来了挑战，同时，在长期的适应进化过程中赋予了这些特有动植物独特的功能优势，以满足生存需要。因此，对极端环境特有动物的优势抗环境压力功能基因的保护和开发，具有极其重要的价值。鼠兔是青藏高原的特有种和关键种，对维持青藏高原生态系统平衡及生物多样性 起到重要作用，已成为土著动物对青藏高原极端压力环境生态适应机制研究的代表性物种。鼠兔是一种典型的冷适应动物，全球鼠兔主要分布在高海拔高纬度的寒冷地区。鼠兔分布的化石资料显示，随着全球气候的变暖，鼠兔的分布范围逐渐缩小，海拔逐渐增高。在长期的进化中，鼠兔形成了独特的生活方式和适应机制来应对高寒低氧的严酷环境，表现为提高氧利用率增强低氧耐受力，提高基础代谢率及非颤抖性产热能力增强低温耐受力。维持机体能量平衡涉及多个信号蛋白的共同参与，其中瘦素(Ieptin)蛋白是能量代谢调节的关键蛋白，是由ob基因编码的主要由白色脂肪组织分泌的激素，与分布于中枢神经和外周组织中的Ieptin受体结合，发挥多种重要的生物学功能，其中最主要的功能是调节机体能量代谢平衡，调节葡萄糖代谢，脂类代谢等。鉴于高原鼠兔严酷的生存环境、显著的能量代谢特征以及I印tin蛋白在能量调节中的关键作用，研究者曾对鼠兔Ieptin基因序列进行了克隆并进行了全面的分子进化分析，得出重要结论长期的适应进化过程中，鼠兔Ieptin蛋白发生了适应性的功能进化，而这种功能的改变更有助于鼠兔更好地耐受这种压力环境。鉴于I印tin蛋白在能量代谢调节中的关键作用，自1994年人ob基因首次被克隆以来，有关人ob基因生物工程产品不断地被开发和利用，已经深入到许多领域包括减肥药物的开发以及肥胖产品的深加工，抗糖尿病药物的研发等。随着对其功能的认识不断深入，有关Ieptin蛋白的产业化前景将更加广阔。然而目前国内外被开发和利用的Ieptin蛋白产品多是从普通环境中生活的人体中分离获得，而从冷环境压力下的特有冷适应动物体内分离的Ieptin蛋白却鲜有报道，然而，对其功能的研究不仅有助于人们认识动物对极端环境生态适应的机制，同时，也为开发和利用其产品提供了科学依据，这方面的研究目前在国内外均处于空白。此外，由于人体会对异种蛋白产生过敏反应，异种蛋白成分越高，发生过敏反应的几率越高，相反，人源化程度越高，发生过敏反应的几率就会明显降低。因此为尽量充分发挥鼠兔Ieptin蛋白的功能优势同时要减少过敏反应,构建人源化鼠兔Ieptin蛋白是一条有效途径
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种新的人源化鼠兔瘦素蛋白及编码该蛋白的基因。本专利技术的另一目的是提供上述人源化鼠兔瘦素蛋白及编码该蛋白的基因的应用。为了实现本专利技术目的，本专利技术的一种人源化鼠兔瘦素蛋白，其具有SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。例如，将第23位的Asp替换为Gly，或是将第122位的Glu缺失，或是在78位添加Ser均不会影响蛋白的功能。本专利技术还提供编码上述蛋白的基因，其具有SEQ ID No. I所示的核苷酸序列。本专利技术还提供含有上述基因的载体以及含有该载体的宿主细胞。本专利技术还提供制备上述人源化鼠兔瘦素蛋白的方法，包括步骤I)采用PCR方法扩增编码人源化鼠兔瘦素蛋白的基因； 2)将扩增片段克隆至表达载体中，并在宿主菌中进行表达。其中，步骤2)中所述表达载体为pMAL_c2x(New England Biolabs,NEB公司)，所述宿主菌为大肠杆菌BL21 (DE3)。诱导表达的具体步骤为1)挑取经鉴定正确的含重组人源化鼠兔瘦素蛋白基因克隆的单菌落，在Iml含100μ g/ml氨苄青霉素的LB培养基中，于37°C，220rpm震荡培养16-18h ；2)按照I : 100的体积比，将细菌培养物加入到新鲜的含100 μ g/ml氨苄青霉素的LB培养基中，于37°C震荡培养至细菌浓度达到OD6tltl = O. 4-0. 5 ；3)加入IPTG至终浓度为ImM，于25°C震荡培养20h，以诱导重组人源化鼠兔瘦素蛋白的表达。上述制备人源化鼠兔瘦素蛋白的方法中还包括对重组人源化鼠兔瘦素蛋白的纯化，具体步骤为a)离心收集菌体，重悬并破碎细胞后离心取上清，上清液经O. 22 μ m滤膜过滤b)将过滤后的上清液以5ml/min流速上样至预先用缓冲液A平衡后的Ni层析柱；c)上样结束后，用缓冲液A以相同的流速冲洗Ni柱，冲洗体积为50个柱体积；d)用缓冲液B洗脱目的蛋白，洗脱体积为5个柱体积，收集洗脱液；e)向洗脱液中加入TEV蛋白酶，4°C酶切过夜后，对酶切产物进行脱盐；f)将酶切产物重新上样至经缓冲液A平衡后的Ni柱中，收集流出液并对流出液进行脱盐。其中，缓冲液A:20mM Tris-Cl, 500mM NaCl，40mM 咪唑，PH = 8· 5 ;缓冲液 B :20mMTris-Cl,500mM NaCl, 500mM 咪唑，PH = 8. 5。本专利技术进一步提供上述人源化鼠兔瘦素蛋白、编码该蛋白的基因、含有该基因的载体或含有该载体的宿主细胞在制备降血糖降血脂药物中的应用。本专利技术的目的还可以采用以下的技术措施来进一步实现。(I)人工合成编码人源化鼠兔I印tin蛋白的核苷酸序列分子进化分析显示鼠兔I印tin蛋白有20个氨基酸位点为鼠兔家族所特有，其性质为适应性进化位点，提示这20个位点是导致鼠兔I印tin蛋白功能增强的关键位点。为此，本专利技术采用人工合成的方式，合成了以人I印tin基因序列为模板，在这20个位点参照鼠兔I印tin基因序列，构建了 20个位点为鼠兔I印tin基因序列的人源化I印tin蛋白基因序列 SEQ ID No. I gtg tec ate tgg aaagtc egg gat gac acc aaa acc ctc ate aag aca att gtc accagg ate aatgac att tea cacacg cat gca gtc tcc tcc aaa cag aaa ate acc ggt ttg gac ttc att cct gca ctccac ccc ate ctg acc tta tccaag atg gac cag aca ctg gtc ctc tac aaa cac ate ctc acc agt atg cct tcc agaaac gtg ate caa atatcc aacgac ctg gag aac ctc egg gat ctt ctt cac gtg ctg gcc gcc tct caa ggc tgccac cca ccc tgg gcc agt ggccts gag acc ctg_ gac agt ctg ggg Qgc gtc ctg_ gaa get tea ggc tac tcc aca gag gtggtg gcc ctg age aggctg cag ggg tct ctg cag gac atg ctg tgg c本文档来自技高网...
【技术保护点】
人源化鼠兔瘦素蛋白，其特征在于，其具有SEQ？ID？No.2所示的氨基酸序列或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：杨洁，赵新全，
申请(专利权)人：中国科学院西北高原生物研究所，
类型：发明
国别省市：
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