一种重组病毒载体及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种重组病毒载体及其应用，该重组病毒载体包括一个病毒载体和至少两条核苷酸序列，所述核苷酸序列分别编码骨保护素和成纤维生长因子，该重组病毒载体能促进牙周组织生长，可用于制备作为治疗牙周病的药物。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因工程技术，尤其是涉及一种用编码骨保护素和成纤维生长因子 的核苷酸序列和病毒载体序列构建的重组病毒载体。
技术介绍
牙周病(periodontitis)在世界范围内均有较高的患病率，在我国更居于龋病之 上。牙周病的患病率和严重性随年龄增长而增高，50 60岁时达到高峰。随着我国进入 老龄化社会，牙周病更将成为突出的影响人类健康和生存质量的问题。牙周病特征性表 现为附着丧失、牙槽骨吸收，在病变牙周组织中各种刺激因素导致的破骨细胞活化，抑 制了牙周组织的成骨能力，造成牙周支持组织不可逆性损害，而牙槽骨的渐进性吸收、 破坏是造成牙齿脱落的主要原因之一。所以，一些学者认为缺损牙槽骨的再修复是一项 全球性的社会和医学问题。而传统的治疗方法对再生组织成分缺乏主动的诱导分化和加 速生长作用，不能使牙周组织完全修复。当前临床治疗重症牙周病的过程中，往往由于手术中患牙位置、患病部位、现 有器械和技术水平等因素，无法根除病变坏死牙周组织、细菌毒素及其代谢产物；其 次，由于口腔是个开放的、多种细菌共生的生态环境，无法避免术后手术部位重新被细 菌所侵袭；同时牙周组织中成骨细胞、牙周膜细胞等在细菌作用下可产生内源性的前列 腺素(PGE)、白细胞介素l(IL-l)、肿瘤坏死因子(TNF)和基质金属蛋白酶等细胞因子， 这些细胞因子可引起牙槽骨吸收及软组织破坏。人体骨骼是动态的不断变化的组织，循环重复着骨吸收-重建，开始于破骨细 胞的分化、成熟、迁移、附着于骨表面并完成骨吸收，随后是成骨细胞形成新骨，这个 过程受成骨细胞调控。成骨细胞/骨髓基质细胞表达破骨细胞分化因子(RANKL)，促进 破骨细胞的分化及骨吸收；同时分泌骨保护素(OPG)，以防止过度骨吸收。在由骨髓基 质细胞向成骨细胞分化过程中成骨细胞分泌RANKL和OPG的比率不同未成熟的成骨 细胞/骨髓基质细胞分泌更多的RANKL，而成熟的成骨细胞分泌更多0PG，以确保骨吸 收和骨形成两个过程紧密相连并达到平衡。OPG属于肿瘤坏死因子受体超家族成员，是RANKL的天然抑制剂，可竞争性 地抑制RANKL与RANK的结合，抑制前体破骨细胞的增殖、分化及存活，抑制成熟 破骨细胞的骨吸收活性，从而抑制骨吸收[6]。Mogi M等(J Dent Res，2004，83(2) 166-169)研究发现，慢性牙周炎患者龈沟液中RANKL浓度增高，OPG浓度明显下降， 牙周炎病人骨吸收病变区黏附的病变肉芽组织中RANKL表达明显高于非牙周炎组织， OPG在非牙周炎组织中表达高于牙周炎组织[7]，提示OPG可促进牙周组织生长。姜新朋等(吉林大学学报，2008，34(4) 633-635)研究发现人牙髓细胞在 不同浓度碱性成纤维生长因子(bFGF)作用下可促进细胞增殖，赵征等(临床口腔医学杂 志2005，21(4) 203-206)经过大量实验也证明FGF-2在成人牙周炎病损组织中表达阳 性率显著高于正常组织，提示FGF-2是牙周病损组织修复的重要细胞因子，可能通过调节人牙周膜细胞(periodontal ligament cells，PDLCs)的碱性磷酸酶(alkaline phosphatase， ALP)活性和合成纤维连接蛋白(fibronectin，Fn)的水平，发挥PDL细胞在牙周组织的再 生中的作用，同时FGF-2能显著地抑制人PDLCs胶原酶II、IV的表达，进而促进牙周组织再生。因此，从骨吸收-重建分子机理入手，应用基因治疗技术增加牙周组织中OPG 分泌，从而抑制RANKL的功能，阻断破骨细胞增殖、分化与成熟，辅以促进组织增殖 FGF-2的应用，来探讨治疗重症牙周病牙周组织缺损的方法。腺病毒载体在自然界分布广泛，具有许多独特的优点病毒基因不与宿主细胞 基因组整合，安全性较好；感染的宿主细胞范围广泛，而且可感染非分裂期细胞；插 入外源基因容量大，制备和操作简便；病毒繁殖滴度高且易于纯化；细胞及动物实验表 明，腺病毒载体很容易将外源基因直接转移到靶细胞中，并使其在细胞内有效表达成活 性蛋白。上述优点，使腺病毒被广泛用于基因治疗的载体。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种能促进牙周组织生长的重组病毒载体。为达到上述目的，本专利技术的技术方案为一种重组病毒载体，该载体包括一 个病毒载体和至少两条核苷酸序列，所述核苷酸序列分别编码骨保护素和成纤维生长因 子。所述病毒载体是腺病毒载体、腺相关病毒载体、SV40病毒载体、反转录病毒载 体、单纯疱疹病毒载体或痘苗病毒载体。所述腺病毒载体是缺失性腺病毒载体。所述腺病毒载体是人腺病毒载体或动物腺病毒载体。所述腺病毒载体是人5型腺病毒载体、35型腺病毒载体、2型腺病毒载体或6型 腺病毒载体。所述编码骨保护素的核苷酸序列见SEQ ID NO 1所示。所述编码成纤维生长因子的核苷酸序列见SEQ ID NO 2所示。所述外源目的基因序列可通过内部核糖体进入位点序列连接，从启动子双顺反 子地表达。本专利技术的重组腺病毒，两个外源基因可同时表达，相互独立，OPG采用CMV 启动子，而FGF的表达则依赖于IRES。所述内部核糖体进入位点序列见SEQ IDNO 3所示。所述外源目的基因序列可融合表达于载体。上述重组病毒载体在制备用于治疗牙周病药物中的应用。本专利技术的重组病毒载体是通过如下方法获得的，利用PCR技术分别扩增出具有 抑制破骨细胞功能的OPG和促进组织增值的FGF-2基因，通过多次克隆构建出含OPG和 FGF-2基因双顺反子穿梭载体，再进一步和骨架质粒pAdeasy-Ι同源重组获得含上述两种 基因的双顺反子重组腺病毒。根据上述方案，首先通过PCR扩增得到所需要的基因，分别插入T载体，将带 OPG的T载体酶切后与同样酶切的带IRES的T载体连接成带OPGI的T载体。再将带 OPGI的T载体酶切，与同样酶切的带FGF的T载体连接成带0PGIFGF的T载体，再将该三个基因克隆入穿梭载体pShuttle-CMV载体，成pSC-OPGIFGF。该载体经过PmeI线 性化，与骨架载体pAdEasy-Ι共同转化BJ5183，得到pFGAd/OPGIFGF重组载体。将该 重组载体经过PacI线性化，然后转染293细胞，得到重组腺病毒载体rAd_OPGIFGF。本专利技术还对得到的重组腺病毒载体进行了药效的动物试验验证试验分为四 组，试验组为翻瓣+胶原膜+局部重组腺病毒，对照分为三组分别为翻瓣+胶原膜； 翻瓣+局部重组腺病毒；翻瓣。其中翻瓣为实验牙部位翻开联骨膜瓣，胶原膜为瑞士盖 特公司生产的胶原纤维编织而成的生物膜。每组的处理过程如下实验组a:将滴有重组腺病毒的胶原膜置于骨质缺损处，缝合固定，冠方平齐龈 缘，轻压组织瓣，使其与骨面贴合，然后轻压龈瓣的冠方，静置8min，缝合龈瓣，术后 两天实验牙部位局部注射重组病毒Iml ；对照组b:翻瓣去骨后，置入未滴加重组腺病毒的胶原膜，缝合龈瓣。对照组c 翻瓣去骨后缝合，实验牙部位局部注射重组病毒1ml。对照组d:翻瓣去骨后缝合通过试验发现注射重组病毒载体对于造牙周缺损的牙的骨高度、丰满度和骨 密度具有促进作用，即具有促进牙周组织生长的作用。利用基因工程和基因治疗技术，在治疗牙周病时既通过手术去除致病因本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组病毒载体，其特征在于：该重组病毒载体包括一个病毒载体和至少两条核苷酸序列，所述核苷酸序列分别编码骨保护素和成纤维生长因子，该重组病毒载体能促进牙周组织生长。

【技术特征摘要】
CN 2009-9-17 200910175555.91.一种重组病毒载体，其特征在于该重组病毒载体包括一个病毒载体和至少两条 核苷酸序列，所述核苷酸序列分别编码骨保护素和成纤维生长因子，该重组病毒载体能 促进牙周组织生长。2.根据权利要求1所述的重组病毒载体，其特征在于所述病毒载体是腺病毒载 体、腺相关病毒载体、SV40病毒载体、反转录病毒载体、单纯疱疹病毒载体或痘苗病毒 载体。3.根据权利要求2所述的重组病毒载体，其特征在于所述腺病毒载体是缺失性腺 病毒载体。4.根据权利要求3所述的重组病毒载体，其特征在于所述腺病毒载体是人腺病毒 载体或动物腺病毒载体。5.根据权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹寅，张梅，何金生，
申请(专利权)人：曹寅，常州市口腔医院，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]