玉米抗除草剂蛋白及其在植物育种中的应用制造技术

本发明专利技术提供了使植物具有除草剂抗性的ALS蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2或4所示。另外，本发明专利技术还提供了相应的核酸、表达盒、载体、细胞、植物、获得具有除草剂抗性的植物的应用和方法、以及鉴定本发明专利技术的植物的方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于植物蛋白质领域，具体而言，本专利技术涉及能赋予植物(尤其是玉米)除草剂抗性(耐受性)的蛋白及其在植物育种中的应用。
技术介绍
农田中杂草是影响农作物产量的最重要因素之一，而人工除草所需要消耗的人力资源和成本很高，而且不便于农业集约化生产，严重制约了农作物种植向高产、优质和低成本方向的发展进程。因此，除草剂就运应而生，其使用为解决农田草害、促进栽培方式的革新及增产中起了很大的作用。常见的除草剂，包括有磺酰脲类、咪唑啉酮类、嘧啶并三唑类、水杨酸嘧啶类等除草剂，目前已经大面积商业推广使用。然而，由于这些除草剂通常也能杀死农作物本身，因此对一般不具有除草剂抗性(耐受性)的农作物而言，除草剂的使用在时间和空间上受到了极大限制，如需要在农作物播种前一段时间使用除草剂。为此，人们研究开发具有除草剂抗性(耐受性)的植物(农作物)，这样可以在种植期间使用除草剂，杀死杂草，但不影响植物本身的生长，由此拓宽了除草剂的使用范围。尽管当前有不少文献报道在某些基因上进行突变再导入野生型植物成为转基因植物，可以给植物带来除草剂抗性，但是实验多针对拟南芥等遗传背景比较清楚的模式植物，但是对于实际种植的农作物，尤其是经过大量前期转基因和/或非转基因育种获得的具有良好性状(同时遗传背景复杂)的农作物来说，往往情况很不乐观，如我们发现，在体外和/或拟南芥导入测试具有除草剂抗性的突变基因，导入玉米等后却发生大量发生了回复丧失除草剂抗性的情况，有些虽然保留了除草剂抗性，但是玉米生长发育不正常而根本无法实践中应用，这很可能是由于玉米中大量基因协同作用的结果。所以，对于复杂遗传背景的植物(如玉米，尤其是改良过的玉米 )，具有除草剂抗性的植物及其真实能起决定性的物质(如蛋白、基因等)目前还没有理论来定向设计出，只能依赖于科研人员艰苦实践而获得，尤其是依赖长期筛选，并且凭借一些运气才能获得。本专利技术人正是长期而艰苦的研究实践，凭借运气偶然地在玉米自交系京21突变植株中发现了一系列(突变)蛋白，其能够在除草剂存在的条件下基本保持原有蛋白的正常植物生理功能，从而使得玉米(尤其是京21)具有除草剂抗性(耐受性)。本专利技术人还开发了这些蛋白及其编码基因在转基因或者非转基因植物育种中的应用，可用于培育具有除草剂抗性的植物，尤其是农作物，如玉米等。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题在于提供新的使植物具有除草剂抗性的蛋白质。另外，本专利技术还提供了编码这些蛋白质的核酸以及基因工程中间体(如，表达盒、载体和细胞等)，获得具有除草剂抗性的植物的方法和应用，并且提供了判断植物是否采用本专利技术方法获得的鉴定方法。具体而言，在第一方面，本专利技术提供了 ALS突变蛋白质，其氨基酸序列如SEQ IDNO:2或4所示。该蛋白质能使植物(如玉米，尤其是京21)具有除草剂抗性。在本文中，ALS就是乙酰乳酸合成酶(acetolactate synthase)的简称,其酶分类编号为EC4, 1.3.18。乙酰乳酸合成酶是支链氨基酸合成中的一个关键酶，如在缬氨酸和亮氨酸的合成中催化丙酮酸生成乙酰乳酸和二氧化碳，在异亮氨酸的合成中催化丙酮酸与丁酮酸生成2-乙醛基-2-羟基丁酸。本专利技术第一方面的蛋白质是经过大量筛选从本专利技术人突变的玉米植株(如，京21)中发现的，能使相应植株具有除草剂抗性。目前，还没有报道表明，在来自玉米的氨基酸序列如SEQ ID NO:2或4所示的突变蛋白，会使得相应植物(尤其是玉米)具有除草剂抗性，更无法预测在保持除草剂抗性的同时，还能保持正常的生长情况。在本文中，京21，又称京21号，是由中国农业科学院作物科学研究所玉米研究中心开发的玉米自交品系，其具有株型紧凑、抗病性好、抗倒伏以及配合力强等性状特点。本专利技术人发现该品系可以在高浓度咪草烟的种子浸泡实验中被筛选出抗咪草烟突变植株。公众可以通过商业渠道获取京21，例如可以从中国农业科学院作物科学研究所玉米研究中心购买。除了本专利技术具体实施方式所述的突变植株筛选和扩增方法之外，在蛋白质序列已知的情况下，本领域技术人员有能力通过改变已知蛋白质的编码基因序列并将其导入表达载体，就可以制备出取代、添加或缺失了氨基酸残基的蛋白质，这些方法记载于《分子克隆实验指南》(北京:科学出版社，2002年)等文献中。通过转基因技术，编码这些蛋白质的基因可以导入植物中，优选导入玉米中，例如导入(野生型)京21中，从而赋予植物抗除草剂性倉泛。目前，以抑制ALS为靶位的除草剂包括磺酰脲类、咪唑啉酮类、嘧啶并三唑类、水杨酸卩密唳类等除草剂(Peter Babczinski, Thomas Zelinsk1.Mode of action herbicidalALS—inhibitors on acetolactate synthase from green plant cell cultures, yeast,and Escherichia col1.Pesticide science, 1991，31:305-323;郑培忠，沈健英.乙酸乳酸合成酶抑制剂的种类及其耐药性研究进展.杂草科学，2009，2:4-8)。因此，在本文中，除草剂抗性指的是对包括磺酰脲类、咪唑啉酮类、嘧啶并三唑类、水杨酸嘧啶类在内的除草剂具有耐受性。优选在本专利技术中，除草剂是咪唑啉酮类除草剂，如在本专利技术的具体实施方式中，除草剂是咪草烟(其化学名称为(RS) 5-乙基-2- (4-异丙基-4-甲基-5-氧代-3-咪唑啉-2-基)烟酸，CAS号为81335-77-5)。即优选在本专利技术中，除草剂抗性是咪唑啉酮类除草剂抗性，更优选是咪草烟抗性。在第二方面，本专利技术提供了核酸，其编码本专利技术第一方面的蛋白质。在本文中，核酸可以是DNA，也可以是RNA，优选是DNA。在知晓所编码蛋白序列或核酸序列的前提下，通过常规的密码子对应关系和宿主表达频率，运用PCR方法、DNA重组法或人工合成的方法，本领域技术人员有能力获得并优化编码本专利技术第一方面的蛋白质的核酸。一旦获得该核酸，就可以将其克隆入载体，再转化或转染入相应的细胞，然后通过常规的宿主细胞进行增殖，从中分离得到大量的核酸。优选本专利技术第二方面的核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO:1或3所示。在第三方面，本专利技术提供了表达盒(cassette)，其包含本专利技术第二方面的核酸。本专利技术第三方面的表达盒优选在5’ -3’ 的转录方向上包含启动子区、本专利技术第二方面的核酸和转录和翻译的终止区。本专利技术第三方面的表达盒优选适合在植物中表达本专利技术第二方面的核酸。示例性的启动子包括来自CaMV35S启动子或者稻肌动蛋白I基因、玉米醇脱氢酶基因、玉米矮缩I基因或烟草花叶病毒(TMV) Q元件的启动子；示例性的转录和翻译的终止区包括转录终止元件或多聚腺苷酸化信号等。本专利技术第三方面的表达盒还可以包括，在细菌中复制所需的复制起点(例如，来自PBR322或P15Aori的ORI区)，土壤杆菌T-DNA转移所需要的元件(例如，T-DNA的左边界和/或右边界)，从而方便从细菌往植物中的转化过程。另外，本专利技术第三方面表达盒还可以包含增强子、内含子、多克隆位点、操纵基因、阻遏物结合位点、转录因子结合位点等，例如来自TMV、玉米褪绿斑点病毒(MCMV)或苜蓿花叶病毒(AMV)的前导序列等本文档来自技高网...

【技术保护点】
ALS突变蛋白质，其氨基酸序列如SEQ IDNO：2或4所示。

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄拔严，石久英，
申请(专利权)人：北京兴博雅生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11