本发明专利技术提供了一种源自壤霉菌（Agromyces?sp.）的卤醇脱卤酶、编码基因及载体，以及其在制备环氧氯丙烷和(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯中的应用。该卤醇脱卤酶氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示，其编码基因序列如如SEQ?ID?NO.1所示。本发明专利技术的有益效果主要体现在：提供了一种来源于壤霉菌（Agromyces?sp.）CCTCC?No：M?2012299的卤醇脱卤酶及其编码基因；该卤醇脱卤酶基因可与表达载体连接构建得到含该基因的表达重组质粒pET28b-Deh，再转化至大肠杆菌BL21中，获得再分别对应转化至大肠杆菌菌株中，获得重组大肠杆菌，该重组大肠杆菌含有卤醇脱卤酶，可以利用重组大肠杆菌为酶源进行生物转化与催化。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种卤醇脱卤酶、编码基因及载体，产卤醇脱卤酶的新菌株，以及其在制备环氧氯丙烷和(R) -4-氰基-3-羟基丁酸乙酯中的应用。
技术介绍
卤醇脱卤酶，也叫卤醇-卤化氢裂解酶，通过分子内亲核取代机制催化芳香族或者脂肪族邻卤醇转化为环氧化物和卤化氢，是微生物降解有机卤化合物的关键酶之一。根据其序列同源性分为HheA、HheB、HheC 3类。有机卤化合物已成为当今重要环境污染物之一，主要是由于排废以及人工合成卤化物的广泛应用造成的。在自然界中，大部分异生质卤化物自降解能力很差，同时许多化合物被疑是致癌或高诱变物质。因此，应用微生物和脱卤酶降解有机卤化物已引起人们广泛的关注，在环境污染治理，特别是手性环氧化物合成方面等具有十分重要的作用。卤醇脱卤酶主要通过蛋白结构中保守的丝氨酸与底物羟基氧原子之间形成氢键， 稳定与底物结合，通过精氨酸降低络氨酸的PKa值，酪氨酸从底物上的氧原子作为亲核试剂，进攻邻位卤素取代的碳原子，进而释放卤离子，形成环氧化物。卤醇脱卤酶不但可以催化碳-卤键的断裂进行脱卤反应，可以高选择性地催化接受除了卤离子以外的一系列非自然亲核试剂，如N3_、NO2' CN—等所介导的环氧化物开环反应，用以生成一系列光学纯的 β_取代醇。因此可以用来合成一些非自然手性化合物。卤醇脱卤酶可以广泛应用于环氧化物以及取代醇。其中叠氮化醇、氰取代醇以及硝基醇是合成氨基醇的前体；手性氨基醇在生物制药领域是一类很重要的化合物，可用来合成多种生物活性物质。异硫氰酸取代醇和噁唑烷酮在农用化学试剂、医药和高分子化学领域中有着广泛应用。近年，已从多种微生物中发现了齒醇脱齒酶，如Agrobacterium radiobacter ADl，Agrobacter sp. AD2，Corynebacterium sp. N—1074，Agrobacterium tumefaciens， Arthrobacter erithii HlOa, Alcaligenes sp. DS—K—S38 ， Pseudomonas sp. DS_k_2DI 等。部分卤醇脱卤酶的基因已被克隆并在大肠杆菌中表达，获得产酶活力较高的基因工程菌，并应用于催化形成环氧化合物及β-取代醇。但是对已有卤醇脱卤酶进行研究的同时， 挖掘新的的微生物来源的卤醇脱卤酶基因仍是今后研究的热点。
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种源自壤霉菌(Agromyces sp.)的卤醇脱卤酶、编码基因及载体，以及其在制备环氧氯丙烷和(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯中的应用。本专利技术采用的技术方案是一种卤醇脱卤酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。本专利技术还涉及编码所述卤醇脱卤酶的基因。所述基因的核苷酸如SEQ ID NO :1所/Jn ο该卤醇脱卤酶基因由如下方法得到利用硫酸铵沉淀和离子交换等分离纯化手段从壤霉菌(Agromyces sp. ) CCTCC NO M 2012299菌株中分离纯化得到脱卤酶蛋白，经过N 端序列测序和肽指纹图谱分析，发现该酶与Arthrobacter sp. AD2和Corynebacterium sp. N-1074的Haloalcohol Dehalogenase HheA存在同源性，以此设计引物。利用PCR 技术，在引物 I (ATGMGNATCGCCCTCGTGACTC)、引物 2 (TTAGGGCAGATAGCC ACCG)的作用下以来源于壤霉菌(Agromyces sp. ) CCTCC NO M 2012299菌株中的总基因组DNA为模板克隆长约O. 75kb的卤醇脱卤酶基因片段。将该片段连接到PMD18-T载体上获得克隆载体 pMD18-T-Deh和转化了 pMD18-T_Deh的重组大肠杆菌。对重组质粒测序，并利用软件对测序结果进行分析，该序列含有一个长为735bp的开放阅读框。该基因核苷酸序列为(SEQ ID NO. I)IATGCGCATCGCCCTCGTGACTCATGCACGGCATTTTGCAGGCCCCGCCGCCGTCGAGGCG61CTTACGCGGGATGGCTATACCGTGGTTTGCCACGACGCGAGCTTCGCTGATGCAGCTGM121CGACAGCGTTTCGAGTCGGAGMCCCGGGCACCATCGCGCTCGCCGAGCAGMGCCCGAG181CGTCTGGTCGACGCCACGCTGCAGTACGGGGMGCGATCGACACGATCGTCTCGMCGAT241TACATTCCGCGCCCGATGMTCGGCTCCCGATCGAGGGMCGAGCGAGGCCGACATCCGA301CAGATGTTCGAGGCGCTCAGCATCTTCCCGATCCTGCTCCTGCAGTCGGCCATCGCGCCG361CTACGGGCTGCAGGCGGCGCCTCCGTTATCTTCATCACGTCCTCGGTTGGCMGMGCCG421CTCGCCTACAACCCTCTCTATGGGCCCGCGCGCGCCGCTACCGTCGCGCTTGTCGMTCG481GCAGCGMGACGCTGTCCCGTGACGGMTCTTGCTCTATGCGATCGGTCCGMCTTCTTC541MCMCCCGACGTACTTCCCGACGTCGGATTGGGAGMCGACCCCGAGCTCCGGGATCGT601GTCGAGCGGGACGTGCCGCTCGGTCGCCTCGGCCGTCCGGACGAGATGGGTGCGCTGATC 661 721ACCTTCCTCG GGCTATCTGCCTTCGCGTCG CCTAATGCAGCGCCCATCGTGGGGCAGTTCTTCGCTTTCACCGGT 利用软件对该基因序列进行分析，推知所述卤醇脱卤酶基因编码SEQ 示的氨基酸序列ID NO. 2 所IMRIALVTHARHFAGPMVEALTRDGYTVVCHDASFADMERQRFESENPGTIALAEQKPE61RLVDATLQYGEAIDTIVSNDYIPRPMNRLPIEGTSEADIRQMFEALSIFPILLLQSAIAP121LRMGGASVIFITSSVGKKPLAYNPLYGPARMTVALVESMKTLSRDGILLYAIGPNFF 181 241NNPTYFPTSD GYLPWENDPELRDRVERDVPLGRLGRPDEMGALITFLASRRMPIVGQFFAFTG本专利技术所述基因源自壤霉菌(Agromycessp. ) CCTCC No M 2012299。本专利技术还涉及一株产卤醇脱卤酶的新菌株-壤霉菌(Agromyces sp.)ZJB120203，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址中国，武汉，武汉大学，邮编430072，保藏编号CCTCC No M 2012299，保藏日期2012年7月25日。本专利技术还涉及一种含有所述卤醇脱卤酶基因的重组载体，以及利用该重组载体转化获得的基因工程菌。本专利技术还涉及所述的基因在制备重组卤醇脱卤酶中的应用。本申请专利技术人根据测序结果设计胞内表达引物3 (CGCCATATGCGC ATCGCCCTCGTGACT C)和弓丨物 4 (CCGC本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种卤醇脱卤酶，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。
【技术特征摘要】
1.一种卤醇脱卤酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。2.编码权利要求I所述卤醇脱卤酶的基因。3.如权利要求2所述的基因，特征在于所述基因的核苷酸如SEQID NO. I所示。4.如权利要求2所述的基因，特征在于所述基因源自壤霉菌(Agromycessp. ) CCTCCNo M 2012299。5.壤霉菌(Agromycessp. ) ZJB120203，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址中国，武汉，武汉大学，邮编430072，保藏编号CCTCC No M 2012299，保藏日期2012年7月25日。6.一...
【专利技术属性】
技术研发人员：郑裕国，薛锋，柳志强，万南微，高爱存，沈寅初，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：
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