本发明专利技术利用实验室保藏的分别携带2-O位脱硫酸化酶基因、3-O位硫酸基转移酶基因的两种质粒，首先通过转化得到重组工程菌；然后在摇瓶中优化了重组菌的生长和诱导产酶等条件，得到大量的2-O位脱硫酸化酶与3-O位硫酸基转移酶；最后将粗酶通过镍柱(Ni-NTA?Agarose?Fast?Flow)进行纯化，快速得到了纯度高达90％的纯酶。在摇瓶优化的基础上，进行高密度发酵，采用提高单位体积菌体浓度的方法进一步提高了两种酶的产量，能够极大地降低两种酶的生产成本，使工业化成为可能，为我们探索和研究肝素多糖的构效关系、硫酸乙酰肝素的作用奠定基础。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种大量制备2-0位脱硫酸化酶、3-0位硫酸基转移酶的方法。属生物医药领域。
技术介绍
肝素应用于临床的历史已有近百年，主要用于抗凝血和抗血栓。然而肝素在临床上尚存有较大的副作用，有时甚至可能导致致死性颅内出 血。这使得它的应用受到很大的限制。尽管这样，临床上仍然广泛用于治疗血栓栓塞性疾病、心肌梗死、心血管手术、体外循环、血液透析。人们试图通过血液监测、减小剂量、局部用药或使用新的剂型等以降低出血的危险性，从而最大限度的发挥肝素的治疗作用。但目前都无法从根本上解决这个问题。然而硫酸乙酰肝素在很大程度上克服了肝素应用的副作用，同时具有类似肝素的抗炎、抗血栓和降血脂等生物作用。硫酸乙酰肝素又叫葡萄糖胺聚糖链，是一类具有电负性的大分子线性聚合物。它广泛存在于哺乳动物以及一些植物体内。该聚合物在机体内不能游离存在，而是通过共价键结合在核心蛋白的丝氨酸与甘氨酸残基上共同组成硫酸乙酰蛋白聚糖。在肝素的基础上进行脱硫酸化与硫酸化得到硫酸乙酰肝素成为现在研究的一个热门研究。肝素的脱硫酸化修饰主要是在肝素结构的2-0-硫酸基、3-0-硫酸基、N-硫酸基、6-0-硫酸基位点。用硅烷化试剂制得6-0-硫酸基完全脱去的肝素，并没有发现其它副反应和解聚现象(Kariya Y, Kyogashima M, Suzuki K, et al. J Biol Chem, 2000, 275 25949-25958)。现研究发现不同位点的脱硫酸化肝素能不用程度抑制血小板与血纤蛋白和血浆蛋白的粘附，其作用强弱为6-0-脱硫酸基> N-脱硫酸基> 2-0-脱硫酸基> 3-0-脱硫酸基产物，由此可见脱硫酸化肝素也可开发为抗血栓药物(Baumann H. Semin ThrombHemost, 2001,27 =445-463.)。并有研究发现6-0和N-脱硫酸化肝素可降低肝素的抗病毒活性，而2-0和3-0位脱硫酸化肝素则基本无影响(Herold B C,Gerber S I,Polonsky T,et al. Virology, 1995, 206 :1108-1116)。现研究也表明硫酸乙酰肝素的抗凝血活性主要通过含有3-位硫酸基氨基葡萄糖的戊糖活性中心结合抗凝血酶(AT-III)，诱导其发生构象改变，从而显示抗凝血活性。其中3-0-位硫酸化由3-0ST完成。这些硫酸基转移酶大多具有多种异构型式，其中，3-0ST-1和3-0ST-5能合成肝素戊糖活性中心。现有研究表明肝素及低分子量肝素都是3-0ST-1和3-0ST-5很好的底物(J. Chen, M. B. Duncan, K. Carricket.，Glycobiology,2003,13 :785-794)。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种大量制备2-0位脱硫酸化酶、3-0位硫酸基转移酶的方法具体技术方案为利用实验室保藏的分别携带2-0位脱硫酸化酶基因、3-0位硫酸基转移酶基因的两种质粒，通过转化得到大肠杆菌重组工程菌；将工程菌按1%接种在带有抗生素卡那霉素的LB培养基中进行菌种活化，活化后接种到装有IOOml培养基的摇瓶中培养一段时间，对重组菌进行诱导产酶优化，分别优化诱导前菌体浓度、诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)的浓度、诱导温度、诱导时间等条件，得到大量含有2-0位脱硫酸化酶与3-0位硫酸基转移酶的菌体溶液；将菌液倒入离心杯4°C离心，倒掉离心杯中的上清液，用bufferA将离心杯中菌体洗脱下来，在冰浴下超生破碎，离心破碎后的菌液，取上清粗酶液，将粗酶液通过镍柱(Ni-NTA Agarose Fast Flow)，上样完后静止30min让酶充分与镍柱螯合，再用BufTerA洗脱杂蛋白，然后用bufferB将螯合的酶洗脱下来，得到了纯度高达90%的纯酶；在摇瓶优化的基础上，将工程菌活化，接种到高密度发酵培养基中进行高密度发酵，控制好温度、PH值、溶氧量、流加速度、诱导前菌体浓度0D600值等条件，采用提高单位体积菌体浓度的方法进一步提高了两种酶的产量。本专利技术能够降低两种酶的生产成本，为其工业化生产提供了新的途径。所述方法中，加入的抗生素卡那霉素为20mg/mL-100mg/ml,优选50mg/ml。 所述方法中，两种重组菌的诱导前，在600纳米下测定的吸光度值(0D600)为O. 6-3. 0，优选 O. 6-0. 8。所述方法中，两种重组菌的诱导剂IPTG的浓度为O. 6mM-2. OmM。优选IPTG的浓度为 I. 2mM。所述方法中，两种重组菌的诱导温度为16°C -30°c，优选诱导温度为20°C。所述方法中，两种重组菌的诱导时间为6_16h，优选诱导时间为10h。所述方法中，上柱缓冲液Buffer A 25mM Tris，0.5M NaCl，IOmM 咪唑，pH 7.0。所述方法中，上柱缓冲液Buffer B 25mM Tris,0. 5M NaCl，500mM 咪唑，pH 7. 0所述方法中，高密度发酵的配方(IL)为:KH2P04，13.5g; (NH4)2HPO4,4. Og5MgSO47H20,1. 4g ;梓檬酸，I. 7g ;微量金属离子，10ml。微量金属离子包含以下金属离子(5M/L HCl溶解)FeS04 7H20,10g/L ；CaCl2 2H20,2. Og/L ；ZnS04 7H20, 2. 2g/L ；MnS04 4H20,0. 5g/L ；CuSO4 5H20，I. Og/L ； (NH4) 6Mo7P0244H20，0. lg/L ；Na2B4O7 IOH20,0. 02g/L。再加 20g/L 的葡萄糖。调节pH值为7.0。所述方法中，流加液为500g/L的葡萄糖与20g/L MgSO4 7H20的混合液，流加速度为 6. 0ml/mino所述方法中，高密度发酵时的诱导0D600值为60左右，诱导后的0D600值为140左右。具体实施例方式下述实施例将具体说明本专利技术的操作方法，但不能作为对本专利技术的限定。下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。实施例I、重组菌的培养条件优化活化所需菌种，接种IOOul菌液入10ml LB培养液中，根据质粒的抗性加入IOul抗生素卡那霉素(50mg/mL)，摇床37°C，200rpm培养过夜。再分别在IOOml培养液中接种Iml已活化的菌液，并加入抗生素lOOul，摇床37°C ;200rpm培养。培养大概2. 5小时，测定0D600，加入诱导剂IPTG诱导，将摇瓶放在摇床上进行低温诱导，诱导10小时左右取出摇瓶，将摇瓶中菌液倒入离心杯中，4000rpm，4°C离心菌液20min。离心后，弃去上清，离心杯中菌体用40ml BufferA洗下来,冰浴,并加入IOmg溶菌酶。再超声波破碎,超声条件超声5S,暂停8S，功率400W，99个循环，共超声3遍，冰水浴。超声完，lOOOOrmp，4°C下离心45min以上，取上清液。实施例2、2-0位脱硫酸化酶与3-0位硫酸基转移酶的纯化上柱前用Buffer A平衡5个柱床体积，流速为2mL/min。再将上清液粗酶上柱，流速为lml/min,为了提本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种大量制备2？O位脱硫酸化酶、3？O位硫酸基转移酶的方法，是利用实验室保藏的分别携带2？O位脱硫酸化酶基因、3？O位硫酸基转移酶基因的两种质粒，首先通过转化得到大肠杆菌重组工程菌；然后在摇瓶中进行了两种重组菌产酶条件的优化，得到了最佳的诱导前菌体浓度、诱导剂IPTG.浓度、诱导温度、诱导时间，同时制备了大量的2？O位脱硫酸化酶与3？O位硫酸基转移酶；最后将粗酶通过镍柱(Ni？NTA？Agarose？Fast？Flow)进行纯化，快速得到了纯度高达90％的纯酶；在摇瓶优化的基础上，将工程菌接种到高密度发酵培养基中进行高密度发酵，采用提高单位体积菌体浓度的方法进一步提高了两种酶的产量。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陈敬华，周斌，刘卫超，王敏，程咏梅，滕丽萍，邓超，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：
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