本发明专利技术公开了一种构建双基因敲除的重组红球菌的方法，包括：(1)根据红球菌的腈水合酶基因序列，设计引物以分别扩增腈水合酶基因的上游序列和下游序列，获得腈水合酶基因的上游片段和下游片段；(2)将腈水合酶基因的上游片段和下游片段插入到自杀质粒中，获得重组自杀质粒，自杀质粒携带卡那霉素抗性基因和蔗糖果聚糖酶基因；(3)利用重组自杀质粒转化敲除了酰胺酶基因的重组红球菌的感受态细胞，获得双基因敲除的重组红球菌，其中包括，通过卡那霉素抗性进行第一轮筛选，获得第一重组菌落，通过蔗糖平板对第一重组菌落进行第二轮筛选。还公开一种高表达腈水解酶的重组红球菌及其构建方法、以及一种制备丙烯酸铵的方法。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及微生物基因工程领域，具体的，本专利技术涉及双基因敲除重组红球菌及 其构建方法，更具体的，本专利技术涉及一种构建双基因敲除的红球菌的构建方法、一种双基因 敲除重组红球菌、一种构建高表达腈水解酶重组红球菌的方法、一种高表达腈水解酶重组 红球菌、高表达腈水解酶重组红球菌在制备羧酸类化合物中的用途以及一种制备丙烯酸铵 的方法。
技术介绍
红球菌是一种好氧的革兰氏阳性放线菌，具有相对较快的生长速率。由于具有强 大的酶和代谢物合成能力，以及对有机溶剂的良好耐受性，红球菌广泛应用于化学品、医药 产品等的生物制备。尤其是高表达腈水合酶的红色(赤)红球菌(Rhodococcus ruber)或紫 红红球菌(Rhodococcus rhodochrous)游离细胞，已经成功用于丙稀酰胺、烟酰胺等化学品 的工业生物催化生产。 腈水解酶(Nitrilase)、酰胺酶(Amidase)和腈水合酶(Nitrilehydratase)，是腈 代谢酶系的三种典型工业酶，广泛用于合成各种重要化学品和医药中间体。例如，微生物腈 水解酶可以直接催化一分子丙烯腈与两分子水发生水合反应，生成丙烯酸和氨(赵孝先等， 山东大学学报，1994,29(2):43~46)，在中性和弱酸、弱碱性溶液中都表现为丙稀酸铵。该 催化反应在常温常压下进行，能耗低，操作简单、安全;丙烯腈转化率高，生成产物单一。此 外，腈水解酶还用于利普妥药物中间体、苦杏仁酸、苯甲酸、羟基乙酸等产品的生物合成。因 此，对于腈水解酶的结构、性能和应用研究也受到广泛重视（徐建妙等，微生物学通报， 2005,32(5): 141~146)。第一个能产腈水解酶的微生物菌种是由Hook和Robinson利用天然 腈化合物蓖麻碱作为唯一碳源筛选得到的假单胞菌(Pseudomonas)，此后有许多研究者利 用特定的腈化合物作为唯一碳源或者唯一氮源筛选到一系列能产腈水解酶的细菌和真菌。 日本利用紫红红球菌R.rhodochrousJ1产生的腈水解酶催化丙稀腈生产丙稀酸，在丙稀腈 浓度较低的条件下，其腈水解酶酶活为18.4U/mL，经过连续24小时的补加丙烯腈进行催化， 丙稀酸的浓度累积到3928凡(似8&8&￥&，6七&1.41'(：11]\1;[(31'013；[01，1988，150:89~94)。王铁 钢等人则对菌株R.rhodochroustgl-A6进行了紫外诱变和培养基优化，腈水解酶活性达到 26.77U/mL，经过10小时的补加丙烯腈连续催化，丙烯酸累积浓度达到414.2g/L(罗晖等，现 代化工，2006,26(S2):109~113;王铁钢等，生物加工过程，2007,5(1):41~44)。 与腈水解酶相比，腈水合酶的研究更为广泛，且腈水合酶催化生产丙烯酰胺的生 物路线已经成功实现产业化生产。在红色红球菌TH中，腈水合酶的表达量可高达总蛋白量 的80 %左右。 由于成本、原料价格、腈水解酶活性和催化工艺等因素的影响，采用腈水解酶催化 的生物法生产丙烯酸(铵）尚未普遍应用。
技术实现思路
本专利技术旨在至少在一定程度上解决上述技术问题之一或至少提供一种商业选择。 依据本专利技术的一方面，本专利技术提供一种构建双基因敲除的重组红球菌的方法，包 括步骤：（1)根据所述红球菌的腈水合酶基因序列，设计引物以分别扩增所述腈水合酶基因 的上游序列和所述腈水合酶基因的下游序列，获得所述腈水合酶基因的上游片段和所述腈 水合酶基因的下游片段；（2)将（1)中的腈水合酶基因的上游片段和腈水合酶基因的下游片 段插入到自杀质粒中，获得重组自杀质粒，所述自杀质粒携带卡那霉素抗性基因和蔗糖果 聚糖酶基因；（3)利用(2)中的重组自杀质粒转化敲除了酰胺酶基因的重组红球菌的感受态 细胞，获得所述双基因敲除的重组红球菌，其中包括，通过卡那霉素抗性进行第一轮筛选， 获得第一重组菌落，通过蔗糖平板对所述第一重组菌落进行第二轮筛选，以获得所述双基 因敲除的重组红球菌。 利用上述本专利技术的这一方面的方法，能够高效的构建出双基因敲除的重组红球 菌，即高效的构建出同时敲除了酰胺酶基因和腈水合酶基因的重组红球菌。构建出的该双 基因敲除的重组红球菌可以作为宿主细胞，用于插入目的基因片段使目的基因得以高效表 达。 根据本专利技术的实施例，上述本专利技术一方面的构建双基因敲除的重组红球菌的方法 还可以具有以下附加技术特征至少之一： 所称的红球菌可以选自目前已知的红球菌，本专利技术对此不作限制。根据本专利技术的 一个实施例，所称的红球菌选自红色红球菌红色红球菌RhodococcusruberTH(R.ruber ΤΗ)和TH3中的一种。红色红球菌R.ruberΤΗ和TH3的生长周期短、酶的表达效率高、工业化 生产工艺成熟，具有很好的工业应用价值。此外，在红色红球菌ΤΗ和ΤΗ3中，天然的腈水解酶 基因几乎不表达，腈水解酶活性几乎为零。所称的自杀质粒(suicideplasmid)，通常为R质粒的衍生质粒，常有宿主范围广 的特点，具有接合转移基因。它的复制需要一种特殊的蛋白，大多数细菌不产生这种蛋白 质，因此，当进入寄主细胞时，要么不能复制、被消除，要么被整合入染色体上，和染色体一 起复制。利用自杀质粒的这个特点，将基因工程技术构建的基因缺失的DNA片段，克隆入自 杀质粒，利用缺失基因两端的同源片段，定位自杀质粒的整合位点。利用同源性DNA片段可 发生重组的原理，构建精确基因缺失菌株。根据本专利技术的一个实施例，（2)中的自杀质粒选 自pkl8mob_sacB和其衍生质粒中的一种。 根据本专利技术的一个实施例，所称的敲除了酰胺酶基因的重组红球菌为敲除了酰胺 酶基因的TH3红色红球菌，可表示为TH3(amdA-）。该工程菌株是清华大学为了减少红球菌 TH腈水合酶催化丙烯腈生产丙烯酰胺过程中的副产物(丙烯酸)积累，采用同源单交换重组 的方法，敲除了染色体上的酰胺酶基因获得的基因工程菌株(ZL200880000969.1;W02009/ 117843;US12/933，725)。将TH3(amdA-）菌株用于催化生产丙烯酰胺，副产物丙烯酸的生成 量降低了80% 以上（Maetal.Bioresourcetechnology，2010,101(1):285_291)〇 根据本专利技术的一个实施例，（1)中的腈水合酶基因的上游片段带有酶切位点 EcoRI/XbaI，（l)中获得的腈水合酶基因的下游片段带有酶切位点Xbal/Hindlll。使得在步 骤(2)中，能够通过双酶切将腈水合酶基因的上游片段和下游片段插入到自杀质粒中。 根据本专利技术的一个较佳实施例，（1)中的扩增所述腈水合酶基因的上游片段的引 物具有如SEQIDNO: 1和2所示的序列，所述腈水合酶基因的上游片段具有如SEQIDN0:3 所示的序列，和/或（1)中的扩增所述腈水合酶基因的下游片段的引物具有如SEQIDN0:4 和5所示的序列，所述腈水合酶基因的下游片段具有如SEQIDN0:6所示的序列。通过上述 设计的特定的引物引入酶切位点，使获得的上下游片段分别带有EcoRI/Xba頂每切位点和 Xbal/Hindin酶切位点。 根据本专利技术的一个实施例，（3)为利用电穿孔本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种构建双基因敲除的重组红球菌的方法，其特征在于，包括：(1)根据所述红球菌的腈水合酶基因序列，设计引物以分别扩增所述腈水合酶基因的上游序列和所述腈水合酶基因的下游序列，获得所述腈水合酶基因的上游片段和所述腈水合酶基因的下游片段；(2)将(1)中的腈水合酶基因的上游片段和腈水合酶基因的下游片段插入到自杀质粒中，获得重组自杀质粒，所述自杀质粒携带卡那霉素抗性基因和蔗糖果聚糖酶基因；(3)利用(2)中的重组自杀质粒转化敲除了酰胺酶基因的重组红球菌的感受态细胞，获得所述双基因敲除的重组红球菌，其中包括，通过卡那霉素抗性进行第一轮筛选，获得第一重组菌落，通过蔗糖平板对所述第一重组菌落进行第二轮筛选，以获得所述双基因敲除的重组红球菌。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：于慧敏，孙继哲，陈杰，罗晖，沈忠耀，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：北京;11
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