本发明专利技术提供了一种双重荧光定量RT-PCR检测试剂盒，包括脱氧三磷酸核苷混合物，MgCl2，RNA酶抑制剂，莫洛尼氏鼠白血病病毒逆转录酶，DNA聚合酶、流感病毒标准品、对照品。本发明专利技术是在目前流行的甲型H1N1流感病毒序列分析的基础上，提供的一种多重荧光定量PCR的分子生物学快速、特异、准确、灵敏的基因诊断方法与诊断试剂盒，可以1个反应管2个小时同时检测区别甲型流感病毒或乙型流感病毒，完善流感检测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属生物
，涉及甲型流感病毒和乙型流感病毒核酸双重荧光定量 RT-PCR检测试剂盒及其应用。
技术介绍
2009年3月18日以来，墨西哥发生了人感染甲型Hmi流感病毒暴发疫情。自墨西哥2009年4月13日出现第1例人感染甲型Hmi流感病毒的死亡病例以来，至5月5日全球已有21个国家经实验室检测确认存在甲型Hmi流感病例，总感染人数上升至IlM例， 其中死亡人数沈例。除墨西哥与美国外，许多国家都报告了甲型Hmi的确认病例。为此， 世界卫生组织(WHO)在将全球流感大流行的警告级别提升到4级，4月四日又进一步提高到5级，这意味着在世卫组织六个管辖区域的一个中，至少有两个国家出现了病毒的人际传播，虽然在此阶段大多数国家不会受到影响，但宣布进入第五级是一个强烈的信号，表明大流行迫在眉睫，充分体现了世界卫生组织对这次新型流感流行的重视程度。在自然界，流感病毒在人以及猪和马等动物，尤其是鸟类中间持续流行。目前，在全球范围内猪群中已造成世界性流行的猪流感病毒血清型仅有H1N1、H1N2、H3N2三种。猪流感是世界上最常见的猪传染病之一，常引起猪的急性呼吸道疾病爆发，其病原猪流感病毒也是甲型流感病毒的成员。猪呼吸道上皮细胞上既有禽流感病毒的受体，唾液酸a_2， 3-半乳糖苷(SA a 2，3feil)又有人流感病毒的受体唾液酸a-2，6-半乳糖苷(SA a 2， 6Gal)。因此，猪群在储存流感病毒、诱导流感病毒新亚型出现的环节上起到了重要作用。有专家对近三十多年来猪流感病毒的重配进行研究，认为从1970年起，在美国的猪群中就已经分离到含有古典猪流感病毒和人流感病毒的重配猪流感病毒，在欧洲和亚洲的猪群中也分离人流感病毒与禽流感病毒的重配毒株，且这些重配病毒在欧洲和亚洲的猪群中持续存在。1984年，在欧洲和亚洲出现的大规模猪流感，很可能也是人源H3N2与禽源 Hmi病毒基因片段在猪体内进行重配的结果。此外，自1998年起，猪群中三源重配的H3N2 病毒在美国广泛流行，该病毒同时含有人流感病毒的HA、NA和PBl基因，北美禽病毒的PB2 和PA基因，以及古典猪病毒的NP、M和NS。猪流感除了对养猪业的影响之外，最突出的流行病学特点是它具有同时感染人和禽的能力，因此猪流感病毒除具有畜牧业传染病上的意义外，在人类的流感流行中也具有重要的公共卫生意义。流行于猪群中的流感病毒有的具有在人体上复制的能力，这就增加了新流感病毒经猪重配后传播给人类的可能性。因此，许多学者认为，猪体内的流感病毒是人类流感病毒的潜在来源，下一次人类流感大流行的流行株基因中，将会有现今流行于猪群中的流感病毒片段，对猪群中的人、猪、禽流感病毒基因的监测，有可能对人类下一次流感大流行的毒株进行预测。一旦这类重配病毒具有较强的传染性、致病性，并能感染人类， 就有可能引起新的世界性流感大流行，这次墨西哥发生的新型甲型(HlNl)流感，也具有这种特点。在流行后期间，流感的活动可能恢复到通常见到的季节性流感水平。此次甲型Hmi流感病毒流行有可能转而表现为季节性A型流感病毒。在此阶段，重要的是持续监测， 这也对检测方法的改进和完善提出了更高的要求。在4月30日公布针对本次甲型Hmi流感病毒的荧光定量检测方法后，近几天又有许多国家和地区公布了甲型Hmi流感病毒的基因序列。但众所周知，流感病毒是一种变异速率非常快的RNA病毒，自然界中像甲型流感病毒这样变异频繁，变异幅度大的生物是少有的，其变异可以通过抗原漂移与抗原转换这二种机制来实现。在流感病毒的8个基因中，HA变异最快，其次是NA。如甲型流感病毒的HAl基因每年每个核苷酸变异的概率为 3 4X 10_3，而细胞染色体DNA的突变率仅为10-8-10-1(1。而HA和NA基因正是甲型Hmi流感病毒检测的重要目标基因。虽然WHO的方法能够检测本次流行的流感病毒，由于流感病毒的高度变异性，同时还应考虑针对我国的猪源流感病毒的监测，因此从方法学的角度去完善流感病毒的检测还需要进行很多探索性工作。鉴于包括人季节性流感、禽流感和甲型Hmi流感在公共卫生中的重要性与日俱增，所以在流感监测工作中同时要进行多种流感病毒的检测，费时费力而且浪费临床标本与试剂。
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种双重荧光定量RT-PCR检测试剂盒。该试剂盒主要是针对甲型流感病毒和乙型流感病毒的双重荧光定量RT-PCR检测试剂盒。本专利技术多重荧光定量RT-PCR检测试剂盒，包含荧光定量RT-PCR反应液，甲型流感病毒标准品、乙型流感病毒标准品、对照品，其中荧光定量RT-PCR反应液管包含RT-PCR反应缓冲液管(含氯化镁和三磷酸脱氧核糖核苷酸混合物等)、两种病毒通用引物管(上下游引物同管装)、相应的两种荧光探针管和酶混合物管(含RNA酶抑制剂、莫洛尼氏鼠白血病病毒逆转录酶和耐热DNA聚合酶等)所述双重荧光定量RT-PCR检测试剂盒的上下游引物和特异性探针序列如下上游引物甲型 infA-FP: 5，- GACCRATCYTGTCACCTCTGAC-3，下游引物甲型 infA-RP: 5，-AGGGCATTYTGGACAAAKCGTCTA-3，特异性探针甲型 infA-P: 5’ -TGCAGTCCTCGCTCACTGGGCAC-3，上游引物乙型-FP 5，-CCCACCRAGCAACAAACG-3，下游引物乙型-RP: 5，-CCTTCCGACATCAGCTTCACT-3，特异性探针乙型-P 5，-CCCGGAACCCATCCCCGGA-3，所述试剂盒流感病毒标准品序列如下甲型流感病毒Gaccaatcttgtcacctctgactaagggaattttaggatttgtgttcacgctcaccgtgcccagtgagcgagg actgcagcgtagacgctttgtccaaaatgccct 乙型流感病毒Cccaccaagcaacaaacgaacccggaacccatccccggaaagagcaactacaagcagtgaagctgatgtcgga agg ο本试剂使用方法如下1.提取待测样品RNA，该步骤所述样品RNA提取可按常规方法进行，如采用德国QIAGEN公司的RNeasy Mini Kit或其它试剂盒，按照试剂盒说明书进行提取；2.以待测样品RNA为模板，RT-PCR缓冲液为onestep RT-PCR缓冲液，其终浓度为 IX，是指缓冲液各组分在反应体系中的终浓度与IXone step RT-PCR缓冲液中各组分的浓度相同。通常采用反应体系体积的2 X one st印RT-PCR缓冲液。1 X one step RT-PCR Master Mix缓冲液的组成参见上海辉睿生物科技有限公司的one step RT-PCR Master Mix, Code :HR-RT04-100。所述特异性引物和荧光探针序列如下上游引物甲型 infA-FP: 5，- GACCRATCYTGTCACCTCTGAC-3， 下游引物甲型 infA-RP: 5，-AGGGCATTYTGGACAAAKCGTCTA-3， 特异性探针甲型 infA-P: 5’ -TGCAGTCCTCGCTCACTGGGCAC-3，上游引物乙型-FP 5，-CCCACCRA本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种双重荧光定量ＲＴ－ＰＣＲ检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包含荧光定量ＲＴ－ＰＣＲ反应液，甲型流感病毒标准品、乙型流感病毒标准品、对照品，其中荧光定量ＲＴ－ＰＣＲ反应液含ＲＴ－ＰＣＲ反应缓冲液、两种病毒通用引物、相应的两种荧光探针和酶混合物，所述ＲＴ－ＰＣＲ反应缓冲液含氯化镁和三磷酸脱氧核糖核苷酸混合物，酶混合物含ＲＮＡ酶抑制剂、莫洛尼氏鼠白血病病毒逆转录酶和耐热ＤＮＡ聚合酶，所述双重荧光定量ＲＴ－ＰＣＲ检测试剂盒的上下游引物和特异性探针序列如下：上游引物甲型ｉｎｆＡ－ＦＰ： ５’－ ＧＡＣＣＲＡＴＣＹＴＧＴＣＡＣＣＴＣＴＧＡＣ－３’下游引物甲型ｉｎｆＡ－ＲＰ： ５’－ＡＧＧＧＣＡＴＴＹＴＧＧＡＣＡＡＡＫＣＧＴＣＴＡ－３’特异性探针甲型ｉｎｆＡ－Ｐ： ５’－ＴＧＣＡＧＴＣＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＧＧＣＡＣ－３’上游引物乙型－ＦＰ： ５’－ＣＣＣＡＣＣＲＡＧＣＡＡＣＡＡＡＣＧ－３’下游引物乙型－ＲＰ： ５’－ＣＣＴＴＣＣＧＡＣＡＴＣＡＧＣＴＴＣＡＣＴ－３’特异性探针乙型－Ｐ ： ５’－ＣＣＣＧＧＡＡＣＣＣＡＴＣＣＣＣＧＧＡ－３’ ；甲型流感病毒标准品：Ｇａｃｃａａｔｃｔｔｇｔｃａｃｃｔｃｔｇａｃｔａａｇｇｇａａｔｔｔｔａｇｇａｔｔｔｇｔｇｔｔｃａｃｇｃｔｃａｃｃｇｔｇｃｃｃａｇｔｇａｇｃｇａｇｇａｃｔｇｃａｇｃｇｔａｇａｃｇｃｔｔｔｇｔｃｃａａａａｔｇｃｃｃｔ乙型流感病毒标准品：Ｃｃｃａｃｃａａｇｃａａｃａａａｃｇａａｃｃｃｇｇａａｃｃｃａｔｃｃｃｃｇｇａａａｇａｇｃａａｃｔａｃａａｇｃａｇｔｇａａｇｃｔｇａｔｇｔｃｇｇａａｇｇ 。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张严峻，
申请(专利权)人：浙江省疾病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：86
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