本发明专利技术提供了一种用于检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的特异性引物和探针组合，包括2对特异性引物和2条与引物对配合使用的特异探针；同时提供一种用于检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的检测试剂盒或检测试剂。具有快速、敏感、特异等优点，可为猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒双重微滴数字PCR绝对定量检测、流行病学调查及疫苗使用等奠定基础。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术设及试剂盒检测
，具体的说设及一种猪流行性腹泻病毒和猪传染 性胃肠炎病毒数字PCR绝对定量检测方法和检测试剂盒。
技术介绍
猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea,PED)是世界范围内发生的猪病之 一，W腹泻、呕吐、脱水和对哺乳仔猪高致死率为主要特征。PEDV与猪传染性胃肠炎病毒 (TGEV)同属于尼多病毒目、冠状病毒科、冠状病毒属，两种病毒的致病机理W及引起的临床 症状极其相似，给养猪业带来严重危害。运两种病的主要传染源是病猪，通过病猪排泄出的 粪便散播病毒，进而污染饲料、饮水和周围环境，健康猪只通过口接触到含有病猪的粪便或 其污染物即可发生自然感染。而且各年龄的猪均易感染，母猪的发病率为15%~90%，而仔 猪和育成猪的发病率通常为100%。病毒传入猪群的途径主要是通过运输病猪的车辆或者 被病毒污染的饲料，W及被病毒污染的鞋、裤、衣物或其它携带病毒的污染物。运两种病多 发生于寒冷季节，主要是在每年的11月至下年4月间发病，尤其在农历春节前后更是该病的 发病高峰期。一般情况下气溫超过20°C不会流行本病，但近年来也有在夏季发生的病例。 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所于2005年~2007年间，对国内部分省、市猪场 腹泻病例进行了RT-PCR检测，结果表明，猪流行性腹泻病(PED)病例占46%、猪传染性胃肠 炎(TGE)病例占15%、猪轮状病毒(PoRV)病例占8%，而PED、TGE和化RV相互间混合感染的病 例占31%。各项研究都表明如何防治死亡率高的猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎，是摆在 我们面前的新课题。 目前，对运两种传染病的诊断方法主要有病毒中和试验，免疫巧光法，免疫电镜 法，ELISA法和RT-PCR法。随着分子生物学的不断发展，ELISA法和RT-PCR法W其敏感性高、 特异性强越来越受到人们的重视。传统的检测方法，如病毒中和试验(VNT)、免疫巧光法、免 疫电镜法、酶联免疫吸附试验等，存在需要时间长、依赖于经验丰富的检测人员、试验操作 复杂、设及活病毒操作、对检测环境要求较高，W及敏感性较低和重复性较差等诸多不足。 RT-PCR等核酸检测方法，虽然较之传统方法具有特异性更强、灵敏度更高、自动化程度更高 和结果重复性更好等优势，但是仅能实现猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪流行性腹泻病毒 (P抓V)的定性和半定量检测，无法对TGEV和PEDV核酸进行精确的绝对定量检测，从而检测 结果无法反映样品中病毒感染的真实情况。同时RT-PCR方法在灵敏度和特异性上仍存在一 定的局限性，对于病毒核酸提取过程中的某些化学物质较为敏感，进而抑制PCR反应，出现 "假阴伴'结果。 数字化PCR(Digi化1 PCR，dPCR)的概念早在1999年就由BedVogelstein采用并发 表相关文献，其初衷是为了能够从临床样品（如尿液、淋己液、血浆、粪便等)大量的正常体 细胞中检测出微量的突变细胞，但由于当时能用于稀释样品的耗材只是384孔板，因此还不 能非常好地体现数字PCR的核屯、理念--"无限稀释"（terminal dilution) eBio-Rad公司 的QX200系统核屯、的微滴化技术能够将一份样品分成20,000个纳升级的微滴，本质上将传 统定量PCR的一个test变成20,000个test,大大提高了核酸序列检测的灵敏度和精准度，是 对"无限稀释"运一概念的完美演绎，其方法原理可称为微滴式数字化PCR(化oplet Digital PCR，ddPCR) dQX200 ddPCR系统包括两台仪器:微滴发生器和微滴分析仪，及其相 关的耗材。微滴发生器将每个样品分成20,000个均匀的纳升级微滴，其中每个微滴或不含 待检核酸祀分子，或者含有一个至数个待检核酸祀分子。每个微滴都作为一个独立的PCR反 应器。随后微滴转移至96孔PCR板上，开展终点PCR扩增。采用微滴分析仪(化oplet reader) 逐个对每个微滴进行检测，有巧光信号的微滴判读为1，没有巧光信号的微滴判读为0,最终 根据泊松分布原理W及阳性微滴的比例，分析软件可计算给出待检祀分子的浓度或拷贝 数。与传统的定量PCR相比，数字PCR的精确度和灵敏度更佳。利用微滴式数字PCR技术，研究 人员可W检测稀有突变，精确测定拷贝数变异，并对基因表达进行绝对定量。癌症相关突变 因浓度较低，往往逃过检测。凭借QX200系统的高灵敏度，研究人员如今可检测浓度低至1/ !，000,000的祀分子。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种具有高灵敏度、高特异性、高准确度和精确度，可实现 精确定量的数字PCR检测方法和数字PCR检测试剂盒，能够同时检测出猪流行性腹泻病毒 (PEDV)和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的双重微滴数字PCR绝对定量检测方法。用于猪流行 性腹泻病毒和传染性胃肠炎病毒的快速定量精确检测。 本专利技术的第一个技术目的是提供用于检测猪流行性腹泻病毒(P抓V)和猪传染性 胃肠炎病毒(TGEV)的特异性引物和探针组合，包括W下2对特异性引物和2条与引物对配合 使用的特异探针，其核巧酸序列分别为： 阳DV-F1:CACCATCAGCACCTCTTTC; 阳DV-R1:CCAGTGCTCATGATCAAAA; 阳DV-P1:FAM-CGACAACACCGTTACCATTATCTAGGA-B册1; TGEV-F1:CAGGGTAGTGAGTATGATTAC; TGEV-R1：CAACCTTTGCTCTCGTAA； TGEV-P1:HEX-ACACAGACCTCCGATACACAGC-B册1。 本专利技术提供了上述的特异性引物和探针组合在制备猪流行性腹泻病毒(PEDV)和 猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)检测试剂盒或检测试剂中的应用。 本专利技术提供了一种含有上述特异性引物和探针组合的试剂盒。所述试剂盒优选为 双重微滴数字PCR绝对定量检测试剂盒。 本专利技术的另一技术目的在于提供一种具有高灵敏度、高特异性、高准确度和精确 度的、操作简单的检测猪流行性腹泻病毒(P抓V)和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的双重微滴 数字PCR绝对定量检测试剂盒，其中包含2对特异性引物和2条与引物对配合使用的特异探 针，其核巧酸序列分别为： 阳DV-F1:CACCATCAGCACCTCTTTC;[001 引 阳DV-R1:CCAGTGCTCATGATCAAAA;阳DV-P1:FAM-CGACAACACCGTTACCATTATCTAGGA-B册1; TGEV-F1:CAGGGTAGTGAGTATGATTAC; TGEV-Rl：CAACCTTTGCTCTCGTAA； TGEV-Pl:HEX-ACACAGACCTCCGATACACAGC-B册1。 还包含病毒总RNA萃取试剂和一步法微滴数字PCR检测试剂;所述一步法微滴数字 PCR检测试剂包括无 RNA酶的蒸馈水，一步法ddPCR探针法预混液，探针法ddPCR微滴发生油， 质控液，阴性对照和阳性对照。 所述病毒总RNA萃取试剂含有TRIz化、氯仿或异戊醇、异丙醇。所述一步法ddPCR探 针法预混液其90化L的配方为：500化的2X One-st邱 RT-ddPCR Superm本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于检测猪流行性腹泻病毒和猪传染性胃肠炎病毒的特异性引物和探针组合，其特征在于，包括以下2对特异性引物和2条与引物对配合使用的特异探针，其核苷酸序列分别为：PEDV‑F1：CACCATCAGCACCTCTTTC；PEDV‑R1：CCAGTGCTCATGATCAAAA；PEDV‑P1：FAM‑CGACAACACCGTTACCATTATCTAGGA‑BHQ1；TGEV‑F1：CAGGGTAGTGAGTATGATTAC；TGEV‑R1：CAACCTTTGCTCTCGTAA；TGEV‑P1：HEX‑ACACAGACCTCCGATACACAGC‑BHQ1。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陈晨，柴方红，王楠，于钦磊，穆国冬，马付坤，闫慧，张静依，
申请(专利权)人：北京佰鸥创投生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11
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