六种猪病毒多重实时荧光定量PCR快速诊断试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了六种猪病毒多重实时荧光定量PCR快速诊断试剂盒，包括如下6对PCR引物：PCV2-F、PCV2-R、PPV-F、PPV-R、PRRSV-F、PRRSV-R、PEDV-F、PEDV-R、PRV-F、PRV-R、CSFV-F、CSFV-R。该试剂盒还包括荧光定量PCR反应液、阳性对照品、阴性对照品和定量PCR标准品。该发明专利技术通过一个PCR反应可以从样本中同时检测出PCV2、PPV、PRRSV、CSFV、PEDV和PRV的存在，比传统的普通PCR和单重荧光定量PCR方法更简便、省时和快捷。

【技术实现步骤摘要】
六种猪病毒多重实时荧光定量PCR快速诊断试剂盒
本专利技术属于病毒核酸检测领域，具体涉及一种六种猪病毒多重实时荧光定量PCR快速诊断试剂盒，可在同一个反应管内同时检测猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)，猪细小病毒(PPV)，猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)，猪瘟病毒(CSFV)，猪流行性腹泻病毒(PEDV)和伪狂犬病病毒(PRV)六种猪病毒，适用于临床及科研中对六种猪病毒的快速定量检测。
技术介绍
近年来，随着养猪业向规模化和集约化方向发展，猪群发生多病原混合感染及继发感染的情况越来越普遍。感染猪细小病毒(PPV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪繁殖与呼吸综合症(PRRSV)、伪狂犬病病毒(PRV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)这几种疾病在临床上呈现出相似的呼吸和繁殖障碍的症状，并且它们常常呈混合感染，而且上述疾病的发生使对其它疾病如猪流行性腹泻的诊断变得复杂和困难，死亡率很高，给养猪业造成重大损失。猪圆环病毒(Porcinecircovirus，PCV)是目前已知的最小的动物病毒。PCV具有PCV1和PCV2两种基因型，PCV1无致病性，PCV2有致病性可引起猪断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)、猪呼吸道传染疾病、猪繁殖系统障碍等疾病。在哺乳期和育成期的猪最易感染此病，流行病学调查表明，PCV2广泛存在于世界各国的猪群中，临床上易与猪呼吸与繁殖综合征病毒(PRRSV)，猪细小病毒(PPV)等其他病原混合感染，表现出多种临床症状和病理变化。猪细小病毒(Porcineparvovirus，PPV)在1967年首次发现于英国，目前世界各个国家均有发现。PPV感染导致的临床症状为胚胎和胎儿死亡、母猪流产、死胎和木乃伊胎等，是引起母猪繁殖障碍性疾病的主要病原之一，同时还可引起仔猪的皮炎和腹泻。近年来，PPV感染呈扩大上升趋势，并呈现出许多新的流行特点，给养猪业造成巨大的经济损失。研究发现，由PPV引起母猪繁殖障碍疾病与感染PRRSV、CSFV等病毒引起的症状难以区别诊断，给PPV的防治带来了一定的困难。猪繁殖与呼吸综合症是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus，PRRSV)引起的以母猪繁殖障碍和仔猪呼吸衰竭为主要症状的传染病，并伴随高死亡率，该病于1987年在美国和加拿大首次发现，现在遍布世界各个养猪国家。临床表现为母猪繁殖障碍，呈现流产、早产、死胎、木乃伊胎及子猪成活率下降等病症。我国1996年首次报道该病的存在，临床和血清调查显示，该病在我国普遍存在，且近年来呈流行态势。猪瘟病毒(Classicalswinefevervirus，CSFV)是一种世界性范围高度接触性传染病，可导致妊娠母猪流产，木乃伊胎、畸胎，死产等症状是引发猪瘟的病原。猪瘟的高致病率和高死亡率给养猪业造成了巨大的经济损失，近十年来它的流行和发病特点发生很大变化,呈非典型化态势，临床症状缺乏规律，严重威胁着养猪业的发展。伪狂犬病病毒(Pseudorabiesvirus，PRV)是引发伪狂犬病的主要病原，可以感染多种家畜和野生动物。对猪的危害极为严重，感染后可引发妊娠母猪流产、产死胎、弱仔及木乃伊胎等症状。该病在猪群中具有死亡率高、传播速度快、流行范围广等特点，我国自1947年首次报道以来，现己扩展到全国二十几个省市，给我国畜牧业特别是养猪业造成了巨大的经济损失。猪流行性腹泻(Porcineepidemicdiarrhea，PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcineepidemicdiarrheavirus，PEDV)引起猪的一种以呕吐、腹泻和脱水为主要特征的肠道传染病。该病以7日龄以内仔猪发病为主，病程短、传播迅速、仔猪死亡率极高，可达100％。1978年，比利时和英国首次报道PEDV疫情，1984年，我国证实该病的存在。在2010-2012年中国不同地区均有PEDV大暴发的报道，造成哺乳仔猪大量死亡，严重影响了我国养猪业的健康发展。常规的病原学和血清学检测很难将这些疾病同时加以区别鉴定，同时又存在操作繁琐、费时费力、敏感度低等缺陷，尤其是多种病原感染时，难以有效进行早期检测，容易产生误判错判。而多重实时荧光定量PCR技术可以一次同时检测多种病原体，并具有高特异性和敏感性、检测时间短、检测成本低等优点，是一种较为理想的检测方法。因此，开发出一种同时特异检测多种猪病毒感染的多重实时荧光定量RT-PCR快速诊断试剂盒，有助于提升病毒检测水平，在疾病诊断和防治及食品安全等方面具有重要的应用前景。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种六种猪病毒多重实时荧光定量PCR快速诊断试剂盒。为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种六种猪病毒多重实时荧光定量PCR快速诊断试剂盒：包括如下6对PCR引物(为六种病毒特异性引物)：PCV2-F：CGAGAAAGCGAAAGGAA，PCV2-R：ACTCGATCAGTAAGTTGCC；PPV-F：GCGTTAGAATAGGATGCGAGGAA，PPV-R：CGCAAGTCCAAAATCACCTGGC；PRRSV-F：TGATAGCACAGCTCCACAGA，PRRSV-R：CCGCGACTTACCTTTAGAGC；PEDV-F：TGGCATTTCTACTACCTCG，PEDV-R：AGTGGGTTCAGTCTTTGC；PRV-F：CGACGGCGTGAACATCCT；PRV-R：GAACTTGTACGTGCGGTGCT；CSFV-F:GCTCCCTGGGTGGTCTAAG；CSFV-R:CTCGTCCACATAGCATCTCG。作为本专利技术的六种猪病毒多重实时荧光定量PCR快速诊断试剂盒的改进：所述试剂盒包括：a)、荧光定量PCR反应液、b)、阳性对照品、c)、阴性对照品和d)、定量PCR标准品；a)、所述荧光定量PCR反应液包含PCR反应缓冲液、荧光染料、DNA聚合酶(酶混合物)、六种病毒特异性引物；所述PCR反应缓冲液包括缓冲液，氯化镁和三磷酸脱氧核糖核苷酸混合物；备注说明：酶混合物含RNA酶抑制剂，M-MuLV逆转录酶和耐热DNA聚合酶；b)、所述阳性对照品为：含PCV2、PPV、PRRSV、CSFV、PEDV和PRV六种病毒的阳性质粒混合品(每种病毒浓度约为300ng/μl)；c)、所述阴性对照品为：灭菌后焦碳酸二乙酯处理水(DEPC-H2O)；d)所述定量PCR标准品由以下6种标准品组成：PCV2标准品、PPV标准品、PRRSV标准品、CSFV标准品、PEDV标准品、PRV标准品。备注说明：上述六种病毒标准品序列如下：所述PCV2标准品序列为：CGAGAAAGCGAAAGGAACAGATCAGCAGAATAAAGAATACTGCAGTAAAGAAGGCAACTTACTGATCGAGTGTGGAGCTCCTAGATCTCAGGGACAACGGAGTGACCTGTCTACTGCTGTGAGTACCTTGTTGGAGAGCGGGAGTCTGGTGACCGTTGCAGAGCAGCACCCTGTAACGTTTGTCAGAAATTTCCGCGGGCTGGCTGAACTTTTGAACGTGAGCGGGAAAATG本文档来自技高网...

【技术保护点】
六种猪病毒多重实时荧光定量PCR快速诊断试剂盒，其特征在于：包括如下6对PCR引物：PCV2‑F：CGAGAAAGCGAAAGGAA，PCV2‑R：ACTCGATCAGTAAGTTGCC；PPV‑F：GCGTTAGAATAGGATGCGAGGAA，PPV‑R：CGCAAGTCCAAAATCACCTGGC；PRRSV‑F：TGATAGCACAGCTCCACAGA，PRRSV‑R：CCGCGACTTACCTTTAGAGC；PEDV‑F：TGGCATTTCTACTACCTCG，PEDV‑R：AGTGGGTTCAGTCTTTGC；PRV‑F：CGACGGCGTGAACATCCT；PRV‑R：GAACTTGTACGTGCGGTGCT；CSFV‑F:GCTCCCTGGGTGGTCTAAG；CSFV‑R:CTCGTCCACATAGCATCTCG。

【技术特征摘要】
1.六种猪病毒多重实时荧光定量PCR快速诊断试剂盒，其特征在于：包括如下6对PCR引物：PCV2-F：CGAGAAAGCGAAAGGAA，PCV2-R：ACTCGATCAGTAAGTTGCC；PPV-F：GCGTTAGAATAGGATGCGAGGAA，PPV-R：CGCAAGTCCAAAATCACCTGGC；PRRSV-F：TGATAGCACAGCTCCACAGA，PRRSV-R：CCGCGACTTACCTTTAGAGC；PEDV-F：TGGCATTTCTACTACCTCG，PEDV-R：AGTGGGTTCAGTCTTTGC；PRV-F：CGACGGCGTGAACATCCT；PRV-R：GAACTTGTACGTGCGGTGCT；CSFV-F:GCTCCCTGGGTGGTCTAAG；CSFV-R:CTCGTCCACATAGCATCTCG。2.根据权利要求1所述的六种猪病毒多重实时荧光定量PCR快速诊断试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括：a)、荧光定量PCR反应液，b)、阳性对照品，c)、阴性对照品和d)、定量PCR标准品；a)、所述荧光定量PCR反应液包含PC...

【专利技术属性】
技术研发人员：姜永厚，饶品彬，吴海港，
申请(专利权)人：浙江理工大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33