本发明专利技术涉及一种快速检测水貂阿留申病病毒的双重PCR方法，是分别合成AMDV非结构蛋白NS1基因片段的特异性引物SEQ.ID.NO 1和SEQ.ID.NO 2，AMDV结构蛋白VP2基因片段的特异性引物SEQ.ID.NO 3和SEQ.ID.NO 4，以上述两对引物为双重引物，以AMDV的DNA为模板，在同一反应体系中进行PCR反应，可完成对AMDV的快速检测。本发明专利技术根据PCR技术原理，根据AMDV的特点，建立了检测AMDV的双重PCR检测方法，其简单、快速、特异性好、灵敏度高，可以用于AMDV的快速检测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术所涉及的是一种用于快速检测水貂阿留申病病毒的双重PCR方法，属于病 毒分子生物学领域。 (二）
技术介绍
水紹阿留申病（Aleutianminkdisease,AMD)是由水紹阿留申病病毒（Aleutian minkdiseaseparvovirus,AMDV)引起的水紹的一种慢性消耗性、超敏感性和自身免疫性 疾病，以终生毒血症、全身淋巴细胞增殖、血清Y-球蛋白增多、肾小球肾炎、动脉血管炎和 肝炎以及持续性病毒血症为特征的一种慢性病毒病。本病在世界各养紹国家均有发生，所 有品系的水貂均能感染，具有阿留申基因型的水貂死亡率可达30%。本病还能使母貂空怀 率和仔貂死亡率显著升高，公貂的交配能力下降，还能影响发育而使毛皮品质低下，同时造 成动物机体抵抗力下降，易于继发或混合感染其他疾病，造成经济损失，是世界公认的养貂 的重大疫病之一。目前本病尚无适用的疫苗可作特异性预防，也无良好的治疗方法，主要的 防控措施是检疫淘汰。水貂慢性传染性疾病，主要侵害水貂的免疫系统，以浆细胞弥漫性 增生和持续性病毒血症为特征。近年来，AMD在有水貂饲养的国家普遍存在，AMD导致水貂 的繁殖力和毛皮质量严重下降，对养貂业造成不可弥补的经济损失。 目前在实际生产中，主要采用碘凝集试验（IAT)、对流免疫电泳法（CIEP)等方法 对阿留申病毒鉴定，费事费力而且会起因其他干扰因素出现假阳性，对于多重感染的鉴定 难以进行。双重PCR方法在检测多种病原微生物感染时具有省时省力、简单快速、敏感高、 特异强等优点，已在多种病毒的鉴定与检测中得到了广泛应用。但PCR方法鉴定的基础是 依据病原的基因型来进行的，目前的研宄表明，AMDV基因组有两个大的开放阅读框架L0RF 和R0RF，负责编码病毒的相关蛋白，其中R0RF编码结构蛋白VP1和VP2,L0RF主要编码非结 构蛋白NS1和NS2。VP1蛋白在协助病毒产生感染性方面起着重要作用，VP2蛋白是该病毒 的主要免疫原性抗原，能体外中和病毒，NS1和NS2对病毒在宿主细胞中的复制起重要的调 节作用。因此可以通过结构蛋白和非结构蛋白设计两对引物对AMDV进行检测。目前，在我 国水貂群中AMD普遍存在，应用双重PCR方法检测AMDV的方法还没有建立，所建立的检测 水貂阿留申病病毒的双重PCR方法具有省时省力、特异性强、敏感性高的高通量检测方法， 为该病的检疫提供一种新的检测方法。 (三）
技术实现思路
本专利技术提供了一种快速检测水貂阿留申病毒的双重PCR方法。本专利技术设计并筛选 了新的特异性引物，优化了反应过程中的各种参数，建立了检测AMDV的双重PCR方法，特异 性更强、敏感性更高，可以快速准确地进行AMDV的检测。 一种快速检测AMDV的双重PCR方法，包括以下步骤：A、通过对GenBank上已发表的AMDV的基因序列进行比对，选择在AMDV的非结构 蛋白NS1基因的保守区与结构蛋白VP2基因的保守区，分别设计一对针对NS1基因片段的 特异性引物SEQ.ID.NO1/SEQ.ID.NO2和一对针对VP2基因片段的特异性引物SEQ.ID.NO3/SEQ.ID.NO4〇【主权项】1. 一种用于快速检测水貂阿留申病病毒AMDV的特异性引物，其特征在于是通过对 GenBank上已发表的AMDV的序列进行比对，选择在AMDV的非结构蛋白NS1基因的保守区与 结构蛋白VP2基因的保守区，分别设计一对针对NS1基因片段的特异性引物SE化ID. NO 1/ SEQ. ID. NO 2和一对针对VP2基因片段的特异性引物SEQ. ID. NO 3/SEQ. ID. NO 4 ; SEQ. ID. NO 1 ;5' -AACACCGCCACTGAGGAC-3，， 沈化 ID. NO 2 ;5' -CGTTACCAGCAGCAAAGT-3，， SEQ. ID. NO 3 ;5, -ACGCATCTACCAAGCAAT-3，， 沈化 ID. NO 4 ;5' -AGGAGGTAGCCCTAAGCA-3'; 所有引物W无菌dd&O配成20pmol/ y 1的浓度备用； 上述引物的使用方法如下： A、 常规方法提取待测水貂组织DNA作为模板；反应体系为；15. 3 y 1 (1地2〇,2. 5 y 1 Buffer, 2 y 1 dNTPs (10. OmM)，SEQ. ID. NO 1 和沈化 ID. NO 2 各 1. 0 y 1，沈化 ID. NO 3 和沈化 ID. NO 4各 1.0yl，lyl DM 模板，0. 2yl Taq酶；PCR 反应条件为；95°C5min;95°C40s， 50^4〇3,72^4〇3,32个循环；72^1〇111111; B、 对步骤A得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测； 如果同时扩增出了 568bp和412bp的产物，则该样品为阳性，样品中含有AMDV ;如果未 扩增出568bp和4^bp的产物，则该样品不含有AMDV。【专利摘要】本专利技术涉及一种快速检测水貂阿留申病病毒的双重PCR方法，是分别合成AMDV非结构蛋白NS1基因片段的特异性引物SEQ.ID.NO 1和SEQ.ID.NO 2，AMDV结构蛋白VP2基因片段的特异性引物SEQ.ID.NO 3和SEQ.ID.NO 4，以上述两对引物为双重引物，以AMDV的DNA为模板，在同一反应体系中进行PCR反应，可完成对AMDV的快速检测。本专利技术根据PCR技术原理，根据AMDV的特点，建立了检测AMDV的双重PCR检测方法，其简单、快速、特异性好、灵敏度高，可以用于AMDV的快速检测。【IPC分类】C12N15-11, C12Q1-70, C12R1-93, C12Q1-68【公开号】CN104531903【申请号】CN201510032647【专利技术人】谢之景, 姜常青 【申请人】山东农业大学【公开日】2015年4月22日【申请日】2015年1月22日本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于快速检测水貂阿留申病病毒AMDV的特异性引物，其特征在于是通过对GenBank上已发表的AMDV的序列进行比对，选择在AMDV的非结构蛋白NS1基因的保守区与结构蛋白VP2基因的保守区，分别设计一对针对NS1基因片段的特异性引物SEQ.ID.NO 1/SEQ.ID.NO 2和一对针对VP2基因片段的特异性引物SEQ.ID.NO 3/SEQ.ID.NO 4；SEQ.ID.NO 1：5’‑AACACCGCCACTGAGGAC‑3’，SEQ.ID.NO 2：5’‑CGTTACCAGCAGCAAAGT‑3’，SEQ.ID.NO 3：5’‑ACGCATCTACCAAGCAAT‑3’，SEQ.ID.NO 4：5’‑AGGAGGTAGCCCTAAGCA‑3’；所有引物以无菌ddH2O配成20pmol/μl的浓度备用；上述引物的使用方法如下：A、常规方法提取待测水貂组织DNA作为模板；反应体系为：15.3μl ddH2O，2.5μl Buffer，2μl dNTPs(10.0mM)，SEQ.ID.NO 1和SEQ.ID.NO 2各1.0μl，SEQ.ID.NO 3和SEQ.ID.NO 4各1.0μl，1μl DNA模板，0.2μl Taq酶；PCR反应条件为：95℃5min；95℃40s，50℃40s，72℃40s，32个循环；72℃10min；B、对步骤A得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测；如果同时扩增出了568bp和412bp的产物，则该样品为阳性，样品中含有AMDV；如果未扩增出568bp和412bp的产物，则该样品不含有AMDV。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：谢之景，姜常青，
申请(专利权)人：山东农业大学，
类型：发明
国别省市：山东;37
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。