本发明专利技术提供了一种呼吸道合胞病毒A/B亚型多重荧光定量PCR检测引物组和探针组及其试剂盒和制备方法。所述引物组序列如SEQ ID NO：1-4所示，所述探针组序列如SEQ ID NO：5-6所示。本发明专利技术还提供了一种呼吸道合胞病毒A/B亚型多重荧光定量PCR检测试剂盒，包括反应管、酶混合物、引物组和探针组，所述引物组的序列如SEQ ID NO：1-4所示，所述探针组的序列如SEQ ID NO：5-6所示。该引物组和探针组及其试剂盒能实现呼吸道合胞病毒A/B亚型的简便分型，具有特异性高、灵敏度高、快速、操作简单方便、成本低廉等多种优点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学检测
，具体设及一种呼吸道合胞病毒A/B亚型多 重巧光定量PCR检测引物组和探针组及其试剂盒和制备方法。
技术介绍
呼吸道感染一直是困扰人类最常见、发生率最高的疾病，是引起老人和儿童因病 死亡最多病因，也是新发和突发传染病的最主要病源因素。每年急性呼吸道感染在发展中 国家导致四至五百万的儿童死亡，死亡的主要病因是肺炎。其中呼吸道合胞病毒（RSV, respirato巧syn巧tial virus)是最常见的致儿童肺炎的病原体之一。 RSV是属于副粘病毒科的负链RNA病毒，可表达11种蛋白。它可W感染有纤毛的气 道上皮细胞并快速的导致细胞损伤，是儿童中最重要的导致毛细支气管炎和肺炎的病原 体。在北京，48%的病毒性肺炎和58%的毛细支气管炎系由RSV引起（1980~1984)，在美国， 20%~25%的婴幼儿肺炎和50%~75%的毛细支气管炎由RSV引起。根据我们呼吸疾病国 家重点实验室对广州地区2009年7月至2012年6月Ξ年的监测结果发现在14岁W下儿童急 性呼吸道疾病患者中RSV阳性率最高，占病原阳性患者的32.5%。 RSV根据其抗原性的差异分为A(RSV-A)和B(RSV-B)两个主要的抗原亚型，两种亚 型独立传播。对于两种亚型RSV感染患者的临床特征的研究一直是RSV感染研究的重要的方 向，对其的研究将为RSV感染的治疗及疫苗的开发提供路径，具有极为重要的意义。 鉴于RSV感染的严重性，急需对其进行有效的防控与治疗。而在进行防控和治疗的 过程中，首先最关键瓶颈就是准确、实用的快速检测鉴定技术。 就目前情况，对RSV-A/B亚型分型检测主要W下几种方法:病毒分离;抗原-抗体反 应;普通RT-PCR/巢式PCR;单重巧光定量PCR。相比较几种方法，前两种方法为经典方法，但 存在要求条件高、周期长、灵敏度不高的问题;PCR方法是近些年来所开发的针对病原体核 酸的检测方法，克服了前面两种方法中存在的周期长、灵敏度不高的问题，特别是巧光定量 PCR方法的引进，解决了 PCR方法容易产生假阳性的问题，使其得到了快速的发展，该方法具 有高特异性、高灵敏度、周期短等多种优点。但目前开发的RSV-A/B检测试剂基本都为单重 巧光定量PCR检测试剂，操作繁琐、费时耗力，同时由于单重试剂无法对样品采集与样品核 酸提取成功与否进行有效监控，具有一定的局限性。
技术实现思路
为克服上述技术缺陷，本专利技术提供了一种呼吸道合胞病毒A/B亚型多重巧光定量 PCR检测引物组和探针组及其试剂盒和制备方法。该引物组和探针组及其试剂盒能实现呼 吸道合胞病毒A/B亚型的简便分型，具有特异性高、灵敏度高、快速、操作简单方便、成本低 廉等多种优点。[000引本专利技术所述引物组序列如569 10^:1-4所示，所述探针组序列如569 10^:5-6 所示。 本专利技术还提供了一种呼吸道合胞病毒A/B亚型多重巧光定量PCR检测试剂盒，包括 反应管、酶混合物、引物组和探针组，所述引物组的序列如SEQ ID NO: 1-4所示，所述探针组 的序列如沈Q ID NO:5-6所示。 本专利技术还提供了一种呼吸道合胞病毒A/B亚型多重巧光定量PCR检测试剂盒的制 备方法，其制备方法包括： (1)步骤一:制备引物[001引制备RSV-A、RSV-B的特异性引物及阳性对照beta-actin的特异性引物； [001引35￥-4、1?5￥-8的特异性引物序列如沈9 10^):1-4所示； 阳性对照beta-actin的特异性引物序列如沈Q ID N0:7-8所示； (2)步骤二:制备探针审恪RSV-A、RSV-B的特异性探针及阳性对照beta-actin的特异性探针，其中探针 分别采用FAM-B册1、Texas red-B册2、J0E-B册1标记； 35￥-4、1?5￥-8的特异性探针序列如沈9 10備：5-6所示； 阳性对照be化-actin的特异性探针序列如沈Q ID NO:9所示； (3)步骤制备RT-PCR反应体系 RT-PCR缓冲液:Pr imeScr ipt-步法RT-PCR试剂盒中的RT-PCR缓冲液；引物使用量:7-15pmol; 探针使用量:〇.5-5pmol; 上述引物探针缓冲液混合物的配制：1祉1/反应 酶混合物:2μ1;模板:化1; 反应总体积:2化1。 与现有技术相比，本方法采用多重巧光PCR的方法对RSV-A/B亚型进行同时检测， 通过加入beta-actin内对照检测监测样品采集及提取情况，具有特异性高、灵敏度高、快 速、操作简单方便、成本低廉等多种优点，可作为RSV-A/B亚型病毒检测的试剂，用于科研及 临床应用。【附图说明】[002引图1 RSV-A/B多重检测试剂中RSV-A灵敏度图谱； 图2 RSV-A/B多重检测试剂中RSV-B灵敏度图谱； 图3 RSV-A/B多重检测试剂中Be化-actin灵敏度图谱； 图4 RSV-A/B多重检测试剂标准曲线。【具体实施方式】 为使本专利技术更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。应理解，运 些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围，下列实施例中未提及的具体实验 方法，通常按照常规实验方法进行。 实施例1 :RSV-A、RSV-B及内参be化-actin引物探针设计及特异性实验 1、引物探针 本方法采用taqman探针技术。通过Genebank中RSV-A、RSV-B的基因序列及beta- actin基因序列资料，分别对RSV-A、RSV-B及beta-actin进行引物探针设计，其中探针分别 采用FAM-B册UTexas red-B册2、1〇6-册91标记。表1为1?5￥-4、1?5￥-8及66化-日。1111引物及探 针序列表。 表 1[003引 2、对照样品 实验采用培养分离的阳性株或临床株进行，阳性株来源于广州呼吸疾病研究所、 呼吸疾病国家重点实验。RSV-A、RSV-B作为阳性对照，同时使用流感A、流感B、副流感1、副流 感2、副流感3、腺病毒ADV、鼻病毒HRV、偏肺病毒HMP、冠状病毒229E、0C43、肺炎支原体MP、肺 炎衣原体CP作为阴性对照，使用E. coli作为be化-actin阴性对照。 3、制备模板实验分别取10化1培养物标本，通过常规RNA/DNA提取方法提取，得到50μ1核酸产 物，使用DEPC水对核酸提取产物100倍稀释后作为模板(其中冠状病毒及偏肺病毒产物稀释 10倍)。 4、反应体系 使用'PrimeScript-步法 RT-PCR 试剂盒（Ver.2)'（TAKARA'PrimeScript One Step RT-PCR Kit Ver.2'）中的RT-PCR缓冲液进行试剂配制，其中 引物使用量为7-15pmol [004引探针使用量为0.5-5pmol 反应总体积为25μ1; 配制试剂体积1祉1/反应(预留化1用于添加酶混合物;预留化1用于添加模板）。 [004 引 5、RSV-A、RSV-B 和 be 化-actin 单重巧光 PCR 反应 为验证所设计的引物和探针的特异性，首先设计单重巧光PCR反应，对引物和探针 进行评估，即分别检测RSV-A、RSV-B和be化-act本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种呼吸道合胞病毒A/B亚型多重荧光定量PCR检测引物组和探针组，其特征在于，所述引物组序列如SEQ ID NO：1‑4所示，所述探针组序列如SEQ ID NO：5‑6所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘文宽，周荣，许多，邱淑燕，
申请(专利权)人：广州医科大学附属第一医院，
类型：发明
国别省市：广东;44
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