一种抗呼吸道合胞病毒的全人源抗体制造技术

本发明专利技术公开了针对RSV的抗体(优选为全人源化的抗体R66)、其编码核酸、包含它的载体和宿主细胞以及它的制备方法。本发明专利技术还公开了针对RSV的抗体(优选为全人源化的抗体R66)在预防和治疗RSV相关疾病中的应用，以及它们在检测RSV中的应用。本发明专利技术提供的针对RSV的抗体优选为是全人源的单克隆抗体，与其它动物源性(如鼠源性)的抗RSV抗体相比，因物种差异导致的免疫原性大大减少，且特异性好、亲和力高，如果用于临床将大大降低副作用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及抗呼吸道合胞病毒抗体或其抗原结合片段，特别是全人源的抗呼吸道合胞病毒(RSV)单克隆抗体。
技术介绍
人源化抗体可以通过用人源抗体的相应部分，取代小鼠抗体对抗原特异性不重要的区域而制备得到。由此得到的重组抗体由于其含有残余的鼠类序列，因此在将其给予病人时，往往会在病人中引发免疫应答反应(人抗鼠反应)。因此，希望制备出不含非人类序列的全人源抗体。人源化抗体已经有过报道，例如利用噬菌体展示技术构建和筛选人源抗体文库，以获得人源化抗体，或者将来自免疫人类供体的淋巴细胞植入重度联合免疫缺陷小鼠(SCID)，以获得人源化抗体，或者利用基因工程技术构建表达人类免疫球蛋白基因的转基因小鼠，以获得人源化抗体。针对致病抗原的完全人源化抗体，也可以通过对脐带血的大量筛选，将包含IgM天然全组分的脐带血进行分离而得到(例如，参见美国专利No.6,391,635)。然而上述这些方法，或者得到的是亲和力低的抗体，或者需要依赖具有特定免疫应答的人类供体。呼吸道合胞病毒(RSV，简称合胞病毒，也属副粘病毒科)是引起小儿病毒性肺炎最常见的病原，可引起间质性肺炎，及毛细支气管炎。在北京，48％的病毒性肺炎和58％的毛细支气管炎系由合胞病毒引起(1980～1984)；在广州，小儿肺炎及毛细支气管炎的31.4％由合胞病毒引起(1973～1986)；在美国，20％～25％的婴幼儿肺炎和50％～75％的毛细支气管炎由合胞病毒引起。RSV感染的潜伏期为2～8天(多为4～6天)。合胞病毒肺炎的典型所见是单核细胞的间质浸润。主要表现为肺泡间隔增宽和以单核细胞为主的间质渗出，其中包括淋巴细胞、浆细胞和巨噬细胞。此外肺泡腔充满水肿液，并可见肺透明膜形成。在一些病例，亦可见细支气管壁的淋巴细胞浸润。在肺实质出现伴有坏死区的水肿，导致肺泡填塞、实变和萎陷。少数病例在肺泡腔内可见多核融合细胞，形态与麻疹巨细胞相仿，但找不到核内包涵体。RSV有两个主要的表面糖蛋白，F和G。两个糖蛋白(90KDa和68KDa)暴露于病毒粒子表面。90KDa的高度糖基化的G蛋白负责将病毒颗粒结合到靶细胞上。68KDa的F蛋白介导病毒被膜与细胞融合和合胞体形成。所述的F和G表面糖蛋白为主要的保护性抗原，核蛋白N和被膜蛋白M2具有较小的保护性活性。抗G糖蛋白的单克隆抗体比抗F糖蛋白的单克隆抗体不太可能中和病毒，且不具有抑制融合活性。F糖蛋白的氨基酸序列在与人感染有关的RSV亚组间有大约90％的保守性。目前唯一上市的抗RSV单克隆抗体只批准用于预防早产儿感染RSV，是抗F蛋白的抗体，该抗体的名称是帕利珠单抗Synagis(MedImmune制造)，是一种人源化的鼠单克隆抗体，该药通过呼吸道合胞病毒融合蛋白阻止病毒向下呼吸道扩散。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供抗RSV抗体或其抗原结合片段，优选为全人源抗RSV单克隆抗体或其抗原结合片段。根据本专利技术的一个方面，涉及抗RSV抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含：至少一个重链CDR，其具有选自SEQIDNO：6、SEQIDNO：8和SEQIDNO：10所示的氨基酸序列；和/或至少一个轻链CDR，其具有选自SEQIDNO：12、SEQIDNO：14和SEQIDNO：16所示的氨基酸序列。进一步地，对于所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含：选自具有如SEQIDNO：6、SEQIDNO：8和SEQIDNO：10所示的氨基酸序列的三个重链CDR；和/或选自具有如SEQIDNO：12、SEQIDNO：14和SEQIDNO：16所示的氨基酸序列的三个轻链CDR。优选地，对于所述的抗体或其抗原结合片段，其包含：具有如SEQIDNO：3所示的氨基酸序列的重链可变区和/或具有如SEQIDNO：4所示的氨基酸序列的轻链可变区，所述抗体是全人源抗RSV单克隆抗体R66。任选地，本专利技术所述的抗原结合片段选自Fab、Fab'、F(ab)2、单链Fv(scFv)、Fv、dsFv、双抗体、Fd和Fd'片段。根据本专利技术的另一个方面，涉及全人源抗RSV单克隆抗体R66。单克隆抗体R66的重链、轻链(KAPPA)的核酸序列分别如SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示，其相应的重链、轻链(KAPPA)的氨基酸序列分别如SEQIDNO：3和SEQIDNO：4所示。本专利技术还涉及通过对上述R66抗体的重链和/或轻链氨基酸序列的插入、取代和/或缺失形成的并具有相同功能的抗体。本专利技术还涉及上述R66抗体的抗原结合片段，特别是选自Fab、Fab'、F(ab)2、单链Fv(scFv)、Fv、dsFv、双抗体、Fd和Fd'片段的抗原结合片段。本专利技术还涉及含有上述抗体(优选为R66)的单个重链和/或单个轻链的单域抗体、嵌合抗体、抗体融合蛋白抗体、抗体/抗体片段-因子融合蛋白或抗体/抗体片段-化学偶联物。本专利技术提供编码上述抗体的核酸，其包含：至少一个编码重链CDR的核苷酸序列，其选自SEQIDNO：5、SEQIDNO：7和SEQIDNO：9；和/或至少一个编码轻链CDR的核苷酸序列，其选自SEQIDNO：11、SEQIDNO：13和SEQIDNO：15。优选地，对于本专利技术所述的核酸，其包含：如SEQIDNO：1所示的编码重链可变区的核酸和/或如SEQIDNO：2所示的编码轻链可变区的核酸。根据本专利技术的另一个方面，提供制备抗RSV抗体(优选为全人源抗RSV单克隆抗体)的方法，包括如下步骤：(1)提供表达载体，所述表达载体含有编码本专利技术的抗RSV抗体(优选为全人源抗RSV单克隆抗体)的DNA分子，以及与所述DNA分子可操作相连的表达调控序列；(2)用所述表达载体转化宿主细胞；(3)在适合所述抗RSV抗体(优选为全人源抗RSV单克隆抗体)表达的条件下培养所述宿主细胞；(4)分离纯化获得所述的抗RSV抗体(优选为全人源抗RSV单克隆抗体)。根据本专利技术的另一个方面，提供包含本专利技术的抗RSV抗体(优选为全人源抗RSV单克隆抗体)的核酸序列的载体以及包含所述核酸序列或载体的宿主细胞。所述载体可以是重组表达载体。所述宿主细胞可以是293T细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NS0、SP2细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝癌细胞、549A细胞、3T3细胞、以及许多其他细胞系。根据本专利技术的另一个方面，提供本专利技术的抗RSV抗体(优选为全人源抗RSV单克隆抗体)、核酸、载体或宿主细胞在制备用于预防或治疗RSV相关疾病的治疗剂中的应用。根据本专利技术的另一方面，提供用于治疗RSV相关疾病的药物组合物，药物组合物中包含治疗有效量的本专利技术的抗RSV抗体(优选为全人源抗RSV单克隆抗体)、核酸、载体或宿主细胞，和一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂。药学上可接受的载体或赋形剂是本领域技术人员熟知的，包括生理相容的水性和非水性载体、稳定剂、防腐剂、增溶剂、抗氧化剂、溶剂、分散介质、外衣层、缓冲液、血清蛋白等。所述RSV相关疾病选自由病毒性肺炎、间质性肺炎、毛细支气管炎组成的组。根据本专利技术的另一方面，涉及本专利技术的抗RSV抗体(优选为全人源抗RSV单克隆抗体)、核酸、载体或宿主细胞在制备用于检测RSV的检测试剂中的应用。本专利技术提供的抗RSV抗体(优选为本文档来自技高网...

【技术保护点】
抗RSV的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含：至少一个重链CDR，其具有选自SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列；和/或至少一个轻链CDR，其具有选自SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列。

【技术特征摘要】
2015.11.30 CN 20151086705191.抗RSV的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含：至少一个重链CDR，其具有选自SEQIDNO：6、SEQIDNO：8和SEQIDNO：10所示的氨基酸序列；和/或至少一个轻链CDR，其具有选自SEQIDNO：12、SEQIDNO：14和SEQIDNO：16所示的氨基酸序列。2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含：选自具有如SEQIDNO：6、SEQIDNO：8和SEQIDNO：10所示的氨基酸序列的三个重链CDR；和/或选自具有如SEQIDNO：12、SEQIDNO：14和SEQIDNO：16所示的氨基酸序列的三个轻链CDR。3.根据权利要求2所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含：具有如SEQIDNO：3所示的氨基酸序列的重链可变区和/或具有如SEQIDNO：4所示的氨基酸序列的轻链可变区。4.根据权利要求1-3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗原结合片段选自Fab、Fab'、F(ab)2、scFv、Fv、dsFv、双抗体、Fd和Fd'片段。5.包含权利要求1-4中任一项所述的的抗体的单个重链、单个轻链或其抗原结合片段的单域抗体、嵌合抗体、抗体融合蛋白抗体、抗体/抗体片段-因子融合蛋白或抗体/抗体片段-化学偶联物。6.编码权利要求1-4任一项所述的抗体或其抗原结合片段的核酸。7.根据权利要求6所述的核酸，其包含：至少一个编码重链CDR的核苷酸序列，其选自SEQIDNO：5、SEQIDNO：7和SEQIDNO：9；和/或至少一个编码轻链CDR的核苷酸序列，其选自SEQIDNO：11、SEQIDNO：13和SEQIDNO：15。8.根据权利要求7所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵雪莲，刘国华，王全英，
申请(专利权)人：天津昊免生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：天津;12