本发明专利技术涉及一种热凝胶多糖产生菌株及其应用，菌株为根瘤菌(Rhizobium sp.)DH-6，保藏编号为CGMCC No.11547，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。将根瘤菌(Rhizobium sp.)DH-6经种子培养和液体深层发酵，制得热凝胶多糖。本发明专利技术提供的热凝胶多糖产生菌株具有所产凝胶多糖凝胶强度高、分子量大、高产等特性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于多糖产生菌株及其应用领域，特别涉及一种热凝胶多糖产生菌株及其 应用。
技术介绍
热凝胶多糖是一种由微生物产生的胞外多糖，由葡萄糖残基通过β-1，3糖苷键 连接而成的葡聚糖，具有受热形成凝胶的特性。热凝胶多糖形成的胶不仅具有很强的热稳 定性，而且具有冻融稳定性，能耐受多轮冻融处理仍保持稳定的结构，可作为食品固型剂、 增稠剂、可食性膜等，也可作为功能性物质改善食品的粘弹性和适口性等品质。作为一种安 全的多糖，热凝胶多糖已被美国食品和药品管理局（FDA)批准可用于食品添加剂，在食品 工业有着广阔的应用前景。热凝胶多糖还具有重要的药理性能，磺酸化的热凝胶多糖具有 抗HIV病毒的活性，在制药工业具有巨大的市场潜力。目前热凝胶多糖工业化生产在日本已获得成功，我国相关生产和研究尚处于起步 阶段。近些年我国虽在热凝胶多糖产生菌种和发酵工艺方面取得了一些进展，提高了热凝 胶多糖的产量，但所生产的热凝胶多糖凝胶强度仍较低，产品性能差，在市场上缺乏竞争 力。 热凝胶多糖产生菌种主要有土壤杆菌属、根瘤菌属和纤维单胞菌菌属等属的细 菌，产生菌种类较少。菌种产热凝胶多糖的量和多糖的凝胶强度间无相关性。有的菌种热 凝胶多糖产量高，但凝胶性差，凝胶强度低；有的菌种产热凝胶多糖凝胶强度高，但产量低。 目前的研究注重通过菌种选育和工艺优化提高产量，而很少结合凝胶特性进行选育菌种和 优化工艺，使得产品的性能不能满足应用需求。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供，该菌株产 生的热凝胶多糖分子量大、凝胶强度高、产量高，具有工业化应用前景。 本专利技术的一种热凝胶多糖产生菌株，所述菌株为根瘤菌（Rhizobiumsp. )DH-6,保 藏编号为CGMCCNo. 11547,核苷酸序列如SEQIDNO. 1所示。 本专利技术的一种热凝胶多糖产生菌株的应用，包括： 将根瘤菌（Rhizobiumsp. )DH_6为出发菌株，经种子培养和液体深层发酵，得到发 酵液，然后分离提纯，干燥，制得热凝胶多糖； 其中种子培养为：在种子培养基中培养，温度为28-30°C，摇床转速180-200rpm， 培养时间16_20h;液体深层发酵为：在发酵培养基中发酵，温度为28°C-30°C，接种量 3%-10% (v/v),摇床转速 200-240rpm，培养时间 3d-5d。 所述种子培养基为：蔗糖 20g/L、（NH)2HP04 3g/L、KH2P04lg/L、MgS04· 7H20 0· 5g/ L、酵母提取物lg/L、CaC03 3g/L，pH= 6. 8-7. 2。 所述发酵培养基为：碳源 60g/L、（NH) 2HP04 2. 3g/L、KH2P04lg/L、MgS04. 7H20 0· 5g/L、有机氮源lg/L、CaC03 3g/L，pH= 6· 8-7. 2。 所述碳源为葡萄糖或/和蔗糖。 所述有机氮源为酵母提取物和/或玉米浆。 所述分离提纯具体为：取发酵液于4500-5000rpm离心3-5min，除去上清液，再加 水补充至原体积，然后按体积比1:1加入〇. 3-0. 6MNaOH溶液，搅拌均匀，静止放置0. 5-lh， 然后于9000-12000rpm离心5-10min，取上清液，加入(λ3MHC1调至最终pH值为中性，再用 80目滤布进行过滤，所得的固形物中再加入1-2倍体积的水，再过滤，最后将过滤得到的固 形物中加入2-3倍体积的95%乙醇，搅匀后于7000-9000rpm离心5-10min。 所述干燥温度为50-60 °C。 所述热凝胶多糖的分子量为2. 25X106-2. 50X106Da，纯度为88-92% (w/w)。 2% (w/v)热凝胶多糖95°C加热lOmin的凝胶强度是760-900g/cm2。 本专利技术的热凝胶多糖产生菌株根瘤菌DH-6(Rhizobiumsp.DH-6)于2015年10月 28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西 路1号院3号中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCCNo. 11547,系从土壤中分离筛 选得到的。 热凝胶多糖产生菌株的筛选方法是从土壤中经平板菌落初筛，摇瓶发酵复筛，经 测定热凝胶多糖产量和凝胶强度而得到。 筛选平板培养基（g/L) :10g葡萄糖，5g酵母提取物，0. 05g苯胺蓝，20g琼脂， pH7. 2. 30°C培养 2 ~3d。 挑选筛选平板上蓝色的菌落，接种于发酵培养基中，30°C培养4d后，取发酵液 95°C加热10分钟，观察能否形成凝胶。对能形成凝胶的发酵液提取其凝胶多糖。 热凝胶多糖产量的测定方法：取一定量发酵液于5000rpm离心5min，除去上清液， 再加水补充至原体积。然后按体积比1:1加入〇. 6MNaOH溶液，搅拌均匀，静止放置1小时。 然后于9000rpm离心lOmin，取上清液，加入0. 3MHC1中和至pH= 7。然后用80目滤布进 行过滤，所得固形物中再加入2倍体积的水，再过滤，最后将过滤得到的固形物中加入3倍 体积的95%乙醇，搅匀后于9000rpm离心10min，取沉淀放入烘箱中60°C干燥。 凝胶强度测定方法：取0. 3g样品于15mL水中，用高速搅拌机使样品在水中分散均 勾，制成悬浮液，将悬浮液转移至18_X180mm的试管中，在真空状态下抽气3min，然后将 试管放入95°C水中加热10min，取出后在冷水中冷却30min。从试管中取出凝胶，取离底部 20mm和30mm处的一段10mm的凝胶，用质构仪进行测定（探头：P5,直径0. 5cm不锈钢活塞 式圆柱体。探头移动速度：250mm/min)。 本专利技术的根瘤菌（Rhizobiumsp. )DH_6,已于2015年10月28日保藏于中国微生 物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCCNo. 11547。 有益效果 本专利技术提供了一株热凝胶多糖产生菌，该菌株产生的热凝胶多糖分子量大、凝胶 强度高、产量高，具有工业化应用前景。采用本专利技术制备热凝胶多糖的方法，热凝胶多糖产 量达23.9 8/1，分子量为2.25\ 106-2.50\1060&，2%热凝胶多糖95°(：加热101^11的凝胶强 度为 760 ~900g/cm2。【附图说明】 图1热凝胶多糖的4NMR图谱。【具体实施方式】 下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术 而不用于限制本专利技术的范围。此外应理解，在阅读了本专利技术讲授的内容之后，本领域技术人 员可以对本专利技术作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定 的范围。 实施例1 菌株的筛选 (1)称取土样10g，加入90mL无菌水，少量玻璃珠放入锥形瓶中，摇床振荡lOmin， 制成土壤悬浊液。 (2)静置lOmin后，取0.lmL加入到0. 9mL无菌生理盐水中，经系列梯度稀释至 10 4、10 5、10 6三个梯度，分别取0.lmL涂筛选平板。 (3)将平板置于30°C培养箱倒置培养2-3d后观察。 (4)挑选菌落变蓝且颜色较深的菌落，在平板上划线，挑取单菌落保藏。将平板上 筛选得到的菌株进一步接种到发酵培养基中进行摇瓶发酵复筛，培养条本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种热凝胶多糖产生菌株，其特征在于：所述菌株为根瘤菌(Rhizobium sp.)DH‑6，保藏编号为CGMCC No.11547，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：杨雪霞，刘毅超，付雅欣，解秀娟，鲁伟，步国建，
申请(专利权)人：东华大学，泰兴市东圣食品科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31
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