一种蜡状芽孢杆菌及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种蜡状芽孢杆菌及其应用。本发明专利技术的蜡状芽孢杆菌已保藏于CGMCC，保藏编号为CGMCC No. 7313，保藏日期为2013年3月15日。将本发明专利技术的蜡状芽孢杆菌配制成菌液后，通过浸种或灌根的方式可以促进黄花蒿的生长，提高黄花蒿中青蒿素的产量，效果较为显著。应用过程中的操作极为简便，可以实现规模化生产，并且无需高昂的前期投入，同时减少了化学肥料的使用。具有理想的应用及开发前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物菌肥
，涉及一种作为天然药用植物内生细菌的蜡状芽孢杆菌，及其在促进黄花蒿生长和/或提高黄花蒿中的青蒿素产量中的应用。
技术介绍
青蒿为菊科植物黄花蒿（ArtemisiaannuaL.）的干燥地上部分，是我国传统使用的一味中草药。从黄花蒿中提取的青蒿素（Artemisinin）是现今最好的抗疟药物，具有活性好、无明显毒副作用等特点，是我国唯一被世界卫生组织（WHO）认可的按照西药标准研究开发的中药。随着研究及应用的深入，青蒿素及其衍生物被广泛用于治疗多种疾病。由于市场需求量逐年增加，而青蒿素在黄花蒿中的含量较低（仅占干重的0.01%~1%），导致青蒿素的供应出现短缺。目前，提高黄花蒿中青蒿素含量的方法主要集中于外加激素法，例如中国专利技术专利CN101785406B等。该类方法大多基于实验室组培苗，对生产条件要求较高，增加了生产成本。另外，向黄花蒿中转入青蒿素合成过程中的关键基因来提高青蒿素含量的方法也有报道，例如中国专利技术专利CN101182544B等。该类方法虽然增效显著，但由于基因工程目前尚处于尝试阶段，同时世界上许多国家对于转基因作物的监管和控制比较严格，导致转基因作物难以在实际中得到普遍应用。随着绿色农业的兴起，人们越来越注重生态保护，生物菌肥也随之得到广泛重视。从植物体内分离出来的内生菌（endophyte），对植物本身并无危害。经大量研究发现，内生菌具有促进宿主植物生长、增强宿主植物抗逆性等作用。因此，将有益内生菌与药用植物共培养是生产高品质中药材的崭新途径，为中草药的高产高质高效栽培提供了广阔的空间。然而，国内外关于生物菌肥的研究主要集中于内生真菌（endophyticfungi），对于内生细菌（endophyticbacteria）的研究较少，特别是针对内生细菌促进黄花蒿生长和/或提高青蒿素产量方面的研究几乎为空白。
技术实现思路
针对上述情况，本专利技术从野生黄花蒿（采自南京紫金山地区）的根茎部分分离筛选出野生型菌株——蜡状芽孢杆菌（Bacilluscereus）SZ1（下文简称SZ1菌）。SZ1菌已于2013年3月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏编号为CGMCCNo.7313，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。本专利技术的SZ1菌具有如下生物学特征：菌落形态特征：SZ1菌在基础NA培养基（NB培养基添加1.5%琼脂）上生长良好，在NA平板培养基上为灰白色，不透明，表面较粗糙，类似毛玻璃或融蜡状，菌落较大；菌体形态特征：菌体呈杆状，末端较方，成短或长链，大小为(1.0~1.2)×(3.0~5.0)μm；生理生化特征：在0℃以下或40℃以上条件下不能生长，在5%和7%的NaCl溶液中能够生长，可以利用葡萄糖、蔗糖、半乳糖、鼠李糖和甘露醇，不可以利用L-阿拉伯糖和肌醇，氧化酶和接触酶测定结果为阳性，能够利用柠檬酸盐，硝酸还原、淀粉水解、明胶液化和酯酶试验为阳性，脲酶试验为阴性。经过序列测定，上述SZ1菌的16SrDNA核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，与蜡状芽孢杆菌（B.cereus）、苏云金芽孢杆菌（B.thuringiensis）、炭疽芽孢杆菌（B.anthracis）的相似度达99%。综合序列同源性分析、Blast比对、形态特征及生理生化特征等实验结果，鉴定上述SZ1菌为蜡状芽孢杆菌。上述SZ1菌对黄花蒿的生长具有明显的促进作用，可以增加根长10%~30%，增加植株鲜重和干重7%~25%，同时可以提高黄花蒿中的青蒿素含量10%~20%，可以应用于促进黄花蒿的生长和/或提高黄花蒿中的青蒿素产量，对人畜无毒害作用，对环境无污染。在实际应用过程中，可以将上述SZ1菌依下法配制成菌液后使用：取SZ1菌菌株置于NB培养基中，在25~30℃条件下，摇床振荡培养10~12小时，离心后去上清，加入无菌水将SZ1菌的浓度调节为107~109cfu/mL，即得菌液，其中NB培养基的配方如下：牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，氯化钠5.0g，蒸馏水1000mL，pH=7.2~7.4。上述菌液的具体应用方式包括浸种（即采用各种浓度的菌液浸泡种子，其中每克黄花蒿种子所需的菌液施用量为5~20毫升，浸泡时间为1~3小时）和灌根（即将各种溶液倾倒在植株根部，其中当黄花蒿幼苗的植株高度为5厘米时，在其根部附近一次性灌入菌液1~2毫升）。与现有技术相比，采用上述技术方案的本专利技术具有如下优点：本专利技术的内生细菌SZ1能够促进黄花蒿的生长，提高黄花蒿中青蒿素的产量，效果较为显著；应用过程中的操作极为简便，可以实现规模化生产，并且无需高昂的前期投入，同时减少了化学肥料的使用。具有理想的应用及开发前景。附图说明图1为蜡状芽孢杆菌SZ1的菌落形态图。图2为蜡状芽孢杆菌SZ1的菌体形态图。图3为基于16SrRNA基因序列构建的SZ1菌株的系统发育树。图4为蜡状芽孢杆菌SZ1通过浸种方式促进黄花蒿生长的盆栽效果对比图，其中左侧两盆为处理组黄花蒿，右侧两盆为对照组黄花蒿。图5为蜡状芽孢杆菌SZ1通过灌根方式促进黄花蒿生长的盆栽效果对比图，其中左侧两盆为处理组黄花蒿，右侧两盆为对照组黄花蒿。具体实施方式下面将结合附图和具体的实施例来进一步描述本专利技术。需要说明的是，本专利技术中选用的所有原辅材料、试剂和仪器都为本领域所熟知，其他本领域熟知的一些试剂和仪器都可适用于本专利技术。实施例一：蜡状芽孢杆菌SZ1的分离、纯化和鉴定。1、内生细菌的分离与纯化：将野生黄花蒿植株依次用自来水、无菌水冲洗干净后，晾干，选取合适的组织剪成5mm×5mm的组织块，在75%乙醇中浸泡1min，用无菌水冲洗3次后，在0.1%升汞溶液中浸泡5min，取出后用无菌水冲洗5次。在无菌研钵内加入10mL无菌水和少许灭菌石英砂，研磨成匀浆，静置30min，取上层溶液并稀释10倍后，再吸取0.1mL至准备好的NA平板上，涂抹均匀后，放入培养箱培养，48h后记录观察，并根据菌落形态、颜色和大小不同挑取单菌落，获得黄花蒿内生细菌。以组织消毒后用无菌水冲洗的第5次冲洗液为对照，涂皿，3d后如有菌落生成，证明表面消毒不彻底，弃去。若对照中无菌落，则研磨液中长出的菌落为内生菌，进行纯化培养，于4℃冰箱中保存，备用。2、菌种鉴定：2.1、菌种形态、生理、生化特征：菌株培养特征观察：将SZ1菌株接种在NA平板培养基、NB液体培养基中，30℃下培养24h，观察描述菌株的菌落形态特征。革兰氏染色：用接种针挑取SZ1菌株菌落，涂布在干净玻片上的一滴无菌水中，风干固定后，用结晶紫混合液染1min，水洗，再用碘液作用1min，水洗，吸干。用95%乙醇脱色至洗脱液无色，用番红液复染2min，水洗风干后观察。生长温度：接种100μL浓度为108cfu/mL的SZ1菌株菌悬液至50mLNB培养基中，分别置于4℃、8℃、12℃、20℃、30℃、37℃、本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus），其已保藏于CGMCC，保藏编号为CGMCC No. 7313，保藏日期为2013年3月15日。

【技术特征摘要】
1.一种蜡状芽孢杆菌（Bacilluscereus），其已保藏于CGMCC，保藏编号为CGMCCNo.7313，保藏日期为2013年3月15日。
2.根据权利要求1所述的蜡状芽孢杆菌，其特征在于：所述蜡状芽孢杆菌的16SrDNA核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。
3.根据权利要求1所述的蜡状芽孢杆菌在促进黄花蒿生长和/或提高黄花蒿中的青蒿素产量中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：将所述蜡状芽孢杆菌依下法配制成菌液后使用：取蜡状芽孢杆菌菌株置于NB培养基中，在25~30℃条件下，摇床振荡培养10~12小时，离心后去上清，...

【专利技术属性】
技术研发人员：王剑文，田浩，马燕军，郑丽屏，
申请(专利权)人：苏州大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32