发明专利技术公开了一种针对c2orf68基因过表达重组质粒pcDNA3.1的构建方法及其在基因功能研究方面的应用。本发明专利技术涉及一种c2orf68基因的mRNA，其核苷酸序列如表中SEQ ID NO.2所示。本发明专利技术还提供c2orf68基因过表达重组真核表达质粒，其序列由图2所示。本发明专利技术还提供了上述过表达载体的构建方法，以及在人肝癌和人结直肠癌中c2orf68基因研究的实验方法。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物工程
，具体为一种能过表达cJ?〇r/你基因表达的真核重 组质粒，以及利用该重组过表达质粒研宄你功能提供了良好工具，也为研宄人肝癌、 人结直肠癌及其它恶性肿瘤中你基因的功能提供有效实验方法。
技术介绍
肝细胞癌（hepatoceLLuLar carcinoma, HCC)，简称人肝癌，在世界范围内是第五 位最常见的癌症，也是死亡率最高的癌症之一。在我国每年因人肝癌死亡的人数超过30 万，仅次于肺癌，位居我国恶性肿瘤死亡率的第二位。结直肠腺癌是人类最常见的恶性肿瘤 之一，近年来，其发病率逐年攀升，占所有恶性肿瘤的第二位。在欧洲，结直肠腺癌占恶性肿 瘤相关致死病因的第二位。在中国的一些大城市，结直肠癌的发病率也达到所有恶性肿瘤 发病率的2到5位。由于大多数恶性肿瘤具有特殊的生物学特性，早期诊断困难，易于发生 转移，手术切除后易复发，所以远期治疗效果不佳。恶性肿瘤的早期发生的分子机制尚未完 全阐明，因此深入了解癌症发生的分子机理，对于研宄开发癌症早期诊断治疗有重要作用。 基因工程，又称为基因重组技术，是二十世纪七十年代发展起来的在体外对DNA 进行操作的一门技术，广泛用于疾病基础研宄、基因治疗、基因免疫、基因疫苗等。其三要素 分别为：酶、目的基因、载体。而真核表达载体是基因工程中用于构建真核基因表达系统的 一种载体，近几十年来，各国学者围绕真核表达载体进行了各种疾病、基因等相关研宄，在 基因工程方面做了大量工作，为医学科学研宄开辟了崭新途径。基因编码的蛋白 C20RF68中，含一个126个氨基酸的UPR)561结构域，属于UPR)561蛋白家族。迄今为止， 尚无任何关于UPR)561蛋白家族的功能报道。 因此，本专利技术运用基因重组技术，针对你基因，构建重组真核表达载体 pcDNA3. l(+)-cJ?or/a9,并将其转染低表达或不表达dor/例的肝癌、结直肠癌等恶性肿瘤 细胞，构建稳定转染堪因的细胞株，为研宄能提供了良好工具，亦为进 一步研宄你基因在肝癌、结直肠癌等恶性肿瘤中的生物学功能打下基础，同时也为 研宄人肝癌、人结直肠癌及其它恶性肿瘤中你基因的功能提供有效实验方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种新型的真核重组质粒及其制备方法，并证明所述重组质 粒为你功能研宄提供了良好的实验工具，也为研宄人肝癌、人结直肠癌等及其它恶 性肿瘤中基因的功能提供有效实验方法。 人你基因已在GenBank注册，注册号ΝΜ_001013649· 3,定位于2ρ11· 2,全长 4283bp，编码166个氨基酸，其核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO :1所述。人基因 的组织表达谱分析显示：该基因在人结直肠癌等胃肠肿瘤中均有表达。本专利技术所述的真核 重组质粒，由序列表SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列中的CY- 与真核载体构 建而成，所述CY- 段是起始密码子下游73bp~573bp的核苷酸序列。 本专利技术所述的真核重组质粒，其制备方法依次包括以下的步骤： (1) 通过半巢式PCR合成人的CY- 基因片段； (2) 将上述获得的核苷酸片段与真核质粒连接，该插入片段的酶切位点分别为Xho I 和EcoR I，再将所述真核重组质粒转化到感受态细菌细胞中进行培养，然后筛选出正确插 入的真核重组质粒的克隆； (3) 使用碱裂解法抽提真核重组质粒，利用限制性内切酶酶切图谱分析所建的真核重 组质粒，并进行DNA序列分析。 (4)将上述获得的重组质粒转染SMMC7721人肝癌细胞、及LoVo人结直肠癌细胞， 观察细胞生物学特性。 (5)实验表明，将所述重组质粒转染入人肝癌及人结直肠癌细胞，重组质粒作用 于人基因可导致结人肝癌细胞的增殖，因此，本专利技术有助于研宄基因功 能，并且为研宄你基因在人肝癌及人结直肠癌中发病的作用提供了有用分子生物学 工具。【附图说明】 图1为本专利技术真核重组载体PCDNA3. 1 (+)的结构示意图。 图2为本专利技术真核重组载体pcDNA3. I (+)+cthm的结构示意图。 图3为本专利技术真核重组载体pcDNA3. 1⑴的酶切鉴定图谱。 图4为本专利技术真核重组载体pcDNA3. 1⑴+GY〃的测序图谱。 图5为本专利技术真核重组载体pcDNA3. I (+)+GY_ e2°rf68的人肝癌细胞SMMC7721照片。 图6为本专利技术真核重组载体pcDNA3. I (+)+CTi2°rf68的人结直肠癌细胞LoVo照片 图7为荧光定量PCR实验中人c2orf68基因引物的标准曲线图。 图8为荧光定量PCR实验中人内参gapdh基因引物的标准曲线图。 图9为转染真核重组质粒的人肝癌细胞株SMMC7721+CTi2° rf68，转染空载体的阴性 对照组SMMC7721_ Ne，未转质粒的空白对照组SMMC7721基因表达的柱状图。 图10为转染真核重组质粒的人结直肠癌细胞株L〇V〇+^2°rf68，转染空载体的阴性 对照组L 0V0^e，未转质粒的空白对照组LoVo基因表达的柱状图。 图 11 为 SDS-PAGE 显示 SMMC772 l+CY-c2〇rf68、SMMC772 Γ NC，SMMC7721 及 LoVo+CY-c2OTf68 、LoV〇- ncS LoVo细胞株中C20RF68蛋白在电泳条带图。 图 12为C20RF68蛋白在SMMC7721+CY-c2〇rf68、SMMC772r NC，SMMC7721&LoVo+CY-c2orf68 、LoVo_ ncS LoVo细胞株中表达水平柱状图。 图13为转染真核重组质粒的人肝癌细胞株SMMC7721+wm，转染空载体的阴性 对照组SMMC772r Ne，未转质粒的空白对照组SMMC7721细胞的增殖图。 图14为转染真核重组质粒的人结直肠癌细胞株LoVo+CTm，转染空载体的阴性 对照组L0V 0^e，未转质粒的空白对照组LoVo细胞的增殖图。 图15为转染真核重组质粒的人肝癌细胞株SMMC7721+ 转染空载体的阴性 对照组SMMC7721_ Ne，未转质粒的空白对照组SMMC7721细胞的流式凋亡检测图。 图16为转染真核重组质粒的人肝癌细胞株SMMC7721+ 转染空载体当前第1页1 2 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种真核重组表达质粒，其特征在于：其c2orf68基因CY‑ c2orf68片段与真核表达质粒重组构建。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陈尧，蒋婷婷，
申请(专利权)人：四川大学，
类型：发明
国别省市：四川;51
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