通过同源重组用于基因断裂的选择细胞的快速方法技术

本发明专利技术提供了用于真核细胞特别基因组位点的特异性改变的方法和载体。一种方法包含利用负－ＡＴＧ（ＡＴＧ－ｍｉｎｕｓ）荧光标记蛋白质基因靶向（ＡＭＦＰ）ＤＮＡ载体，目的是为了产生和鉴别经过位点特异性同源重组把载体序列整合进宿主细胞基因组的细胞。该方法也包含利用编码体内可发现标记的序列，鉴别经过位点特异性同源重组或是非同源重组或是插入而把外源载体序列整合进了宿主细胞的基因组的细胞。本发明专利技术也包括在真核细胞内产生修饰的载体。另外，本发明专利技术包括通过实施和使用提供的方法和载体，从具备特异性遗传改变的细胞生成的细胞和有机体。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

技术介绍
专利
本专利技术主要涉及以修饰遗传位点为目的的细胞控制，本专利技术具体涉及在细胞中用于产生遗传修饰的载体和方法。
技术介绍
为了各种目的，在不同实例中外源性遗传物质稳定介入原核生物和真核生物的基因组已成功完成，例如，外源基因的表达或内源基因座的断裂。其主要通过或随机基因组插入或位点特异性同源重组完成。随机整合包含线性DNA片段在大部分为非位点特异性的位置插入宿主细胞的基因组。这些插入倾向以多聚体或多联体存在，大多数不导致特殊基因座的断裂和失活。内源基因位点可以由于随机插入事件而断裂的可能性也是存在的，这样外源基因对转换细胞衍生的细胞或有机物的作用的分析具有困难。另外，依靠整合区域可以获得外源启动子活性的有效范围。通过位点特异性同源重组，DNA插入宿主基因组，获得宿主基因组特殊区域的靶向以至外源DNA的单拷贝整合。同源重组涉及通过特异重组酶的作用，有效改变相似核苷酸序列。早期设计的试验以酵母为模型系统，用外源性DNA在以位点特异性的方式控制细胞内源性基因组DNA序列。重组在酵母基因组和通过在leu2.sup位点转化导入的外源质粒之间展示(Hinnen等人.(1978)，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，75，1929)。最近，哺乳动物细胞的同源重组潜力的利用已获得在细胞内源基因组DNA中特异突变DNA序列的形成。在干细胞和所述细胞(见后)生成的动物两者中已生成功能增加和功能丢失的等位基因。另外，正-负选择性载体和方法的应用促进了含突变DNA序列的细胞和动物的生成和研究(Capecchi等人.(1997)U.S.专利#5,631,153)。到目前为止，已设计的两种主要载体类型允许在靶向基因组的特异区用外源DNA序列替代内源序列。这些载体已证明在大量不同类型细胞足以产生各种靶向等位基因。插入载体包含两个同源区域，侧于编码可选择标记的内核苷序列。该载体被线性置于同源区域之一。一个单独交换事件和同源重组导致基因序列的部分复制。染色体内的重组常导致内源性复制序列的排斥。这种类型的靶向载体的缺点是缺乏负性可选择标记，其通过消灭包含主链和载体序列的细胞可以有效增进正确的靶向。另外，在同源区域内的线性化减少了能用于同源重组的DNA序列的数量，这样就降低了链交换机会(Thomas等人.(1986)，Cell，44，49)。最终，染色体内的重组必须产生在限定区域或者可以发生位点的不稳定型有机物的再生。替代载体通常包含两个侧于可选择的正标记的同源区域，例如编码新霉素转磷酸酶的基因。一个负的可选择标记常居于外侧但是毗邻于同源区域的某一个，通过灭活含有负性可选择序列盒的细胞以在整个群体中提供准确的靶向细胞的富集。通过同时或者逐步的正性和负性选择尾随替代载体导入细胞导致细胞分离，由于负性可选择标记的应用，进行区域特异的同源重组的可能性增加了8-12倍。或许，在哺乳动物细胞第一次成功的基因靶向试验，Capecchi等人展示了通过载体替代的应用靶向小鼠HPRT和int-2位点(Capecchi等人.，(1997)，U.S.专利#35,631,53)。从此，更多的位点被成功靶向，一些是通过插入载体，大多数是通过替代载体。这些载体中的多数包括了位于同源区域的一侧或两侧外部的负性可选择标记，其常导致靶向等位基因鉴别效率的提高。迄今不利因素的多少与替代载体和正-负选择的方法和利用有关。负性可选择盒的大量应用如HSV胸苷激酶需要加入一种抗生素或选择的试剂，例如更昔洛韦(gancyclovir)，其可以取消细胞的应激和不需要的或早熟的分化。另外，由于缺乏可选择标记而耐药，用负性可选择标记选择富集细胞要花费相当时间使细胞恢复。此外，用这种方法获得典型的富集因子至少是8-12倍之间。同样的，正-负选择载体的生产常有策略困难和时间消耗。已经设计了可选择的正选择方法，其不包括正-负选择的利用。这些方法包括通过框内基因与靶基因融合和显性可选择标记的条件表达策略的应用。利用耐受标记新霉素转磷酸酶Sedivy等人展示多瘤中层T抗原(pmi)位点的成功基因靶向(Sedivy等人(1989)，国家科学院报告(Proc.Natl.Acard.Sci.)，86，227)。然而，一种药的可选择耐受标记的实施以检测位点介导的同源重组事件对经历选择的细胞是有侵袭性和有毒性的。本专利技术围绕这些问题描述了该技术。通过位点特异性的同源重组，有特异突变位点的胚胎干细胞也已产生许多动物。这些动物包括来自于嵌合物的小鼠，其是通过在特异位点同源重组靶向的胚胎干细胞注射胚泡产生。有些例子包括p53和paraxis位点(Donehower等人.(1992)，自然，356，215；Burgess等人.(1996)，自然，384，570)。猪也可以来自包括猪的同源重组修饰的胚胎干细胞。(Butler等人.(2002)，自然，415，103)。专利技术概述本专利技术提供在真核细胞通过用靶DNA同源重组载体DNA修饰基因组DNA序列的方法。本方法首先要求的是具备用载体进行同源重组能力的细胞的转化，此处是指负ATG荧光蛋白基因靶向载体(AMFP)含有大体与细胞的基因组中的序列相似的序列(附图说明图1、2、3)。整合进宿主细胞基因组载体的大部分基本是随机形式发生，没有优先的基因组的特别区域。但是，有理由提示，通过位点特异性的同源重组，一定比例的AMFP基因靶向载体将整合进宿主细胞基因组。随后的细胞选择将获得已经成功进行位点特异性的同源重组的细胞的分离和鉴别(图4)。该选择是基于AMFT置换载体的结构和组成。载体组成为与宿主细胞基因内存在的序列明显同源的第一DNA序列。另外，载体包含第三DNA序列，其与宿主细胞基因组第一序列的下游或上游的其他序列明显同源。在这两个区域之间，载体含有第二DNA序列，其与宿主基因组存在的序列非明显同源，其赋予细胞鉴别载体序列整合进所述基因组的能力。第二DNA序列是有用的，它能鉴定经过内源序列进行载体同源重组的细胞。另外，通过实施和使用提供的步骤和载体，本专利技术包括具有特异遗传修饰细胞产生的细胞和生物。在第一实施例中，本专利技术提供一种方法，鉴别利用AMFP基因靶向载体进行了位点特异性同源重组的转化细胞。该方法包括 a)用AMFP基因靶向载体转化细胞，该载体被设计进行位点特异性的同源重组，其中载体包括与宿主基因组内存在的内源基因组序列实质上同源的第一DNA序列；第二DNA序列，其缺乏足以驱动其表达的调节因子，在所述细胞编码缺乏编码初始蛋氨酸的核苷序列的荧光蛋白可选择标记，与细胞内源基因组序列为非同源，因此不能进行位点特异性的同源重组；第三DNA序列，其与存在于宿主基因组的内源基因组序列实质上同源，但不同于第一DNA序列。其中通过有内源基因组靶序列的第一DNA序列和有内源基因组靶DNA序列的第三DNA序列之间的链交换，载体能进行细胞内位点特异性同源重组。其中在AMFP载体中的DNA序列的结构是实质上与靶DNA序列同源的第一DNA序列，缺乏足以启动其表达并编码缺乏编码初始蛋氨酸的核苷序列的荧光蛋白可选择标记的调节因子的第二DNA序列，实质上与靶DNA序列同源的第三DNA序列；b)繁殖细胞以选择或富集用所述AMFP载体成功转化，并通过选择存在的所述第二DNA序列本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鉴定转化细胞的方法，该转化细胞经过利用ＡＭＦＰ载体进行了位点特异性同源重组，所述的方法包含：ａ）设计用ＡＭＦＰ载体转化的细胞以进行位点特异的同源／重组，其中所述的载体包括：实质上与宿主基因组的内源基因组序列同源的第一 ＤＮＡ序列；第二ＤＮＡ序列，该序列编码在所述细胞中编码特征性缺乏调节因子和编码初始蛋氨酸的序列的荧光蛋白选择，并且与细胞内源性基因组序列非同源，因此不能进行位点特异性同源重组。实质上与宿主基因组的内源基因组序列同源，并且与第 一ＤＮＡ序列不同的第三ＤＮＡ序列；ｂ）　通过选择存在所述第二ＤＮＡ序列的功能性荧光蛋白可选择标记的基因产物，繁殖细胞以选择或富集那些用所述ＡＭＦＰ载体转化的细胞。ｃ）从没有所述第二ＤＮＡ序列的细胞中分离具有所述编码功 能性荧光蛋白可选择标记的第二ＤＮＡ序列的细胞。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：RM小伯吉斯，PA施奈德，
申请(专利权)人：基因组生物科学有限公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]