一种通过同源重组敲除ura5基因的高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷型及其构建方法技术

本发明专利技术涉及一种高山被孢霉（Mortierella?alpinaATCC32222）的尿嘧啶营养缺陷型菌株及其构建方法。本发明专利技术采用高山被孢霉ATCC32222为材料，运用根癌农杆菌介导的遗传操作技术进基因敲除，得到一株高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷型，对产油真菌高山被孢霉ATCC32222的基础理论研究及产品开发具有重要的意义。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术涉及一种高山被孢霉（Mortierella?alpinaATCC32222）的尿嘧啶营养缺陷型菌株及其构建方法。本专利技术采用高山被孢霉ATCC32222为材料，运用根癌农杆菌介导的遗传操作技术进基因敲除，得到一株高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷型，对产油真菌高山被孢霉ATCC32222的基础理论研究及产品开发具有重要的意义。【专利说明】—种通过同源重组敲除ura5基因的高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷型及其构建方法【
】本专利技术涉及一种高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷型菌株及其构建方法，属于生物工程
。【
技术介绍
】高山被孢霉是一种重要的花生四烯酸(ARA)生产菌株，它具有ARA含量高、安全、多不饱和脂肪酸(PUFAs)组成合理等特点，已经应用于工业生产ARA。目前对高山被孢霉的研究主要集中在菌种选育和发酵条件优化等方面。高山被孢霉的基因操作系统目前还没有被很好的建立起来。这就对高山被孢霉脂肪酸合成途径的基础理论研究和基因工程改造形成了极大的障碍。目前广泛使用的丝状真菌转化筛选标记有以下三种:营养缺陷型标记、抗生素抗性标记和荧光报道基因。营养缺陷型菌株经基因工程改造后，无外源抗性标记基因残留，可以用于工业生产。所以，获得性状良好的营养缺陷型菌株在工业微生物育种、遗传学、医学、食品生物技术等领域都有着非常重要的作用。但是，目前获得丝状真菌营养缺陷型菌株主要依赖于诱变筛选的方法。这种方法效率极低且经常伴随着基因组中其他位置DNA序列中未知的突变。这种由诱变得来的无表型特征的带有遗传背景隐患的菌株可能为以后的基因工程改造和工业生产带来不可预知的麻烦。利用同源重组实现的基因敲除方法可以在不影响基因组中其他基因的前提下破坏目的基因，使目的基因编码的蛋白丧失功能，而且，与随机诱变相比，同源重组效率相对较高，通过同源重组获得目的菌株的重复性好。可见，利用同源重组定向打断目的基因，是获得优良营养缺陷型菌株的最佳方法。但是，对于丝状真菌来说，同源重组的效率受很多因素的影响:同源序列的长度、相似性、G/C含量、靶基因的转录状态、非同源末端连接、染色质结构和转化方法。在一些酵母菌中，同源序列只需达到50-100bp即可实现同源重组；而丝状真菌通常需要Ikb以上甚至几kb的高质量同源性序列。并且不同菌株、不同基因的敲除需要满足不同的条件，些许 的序列差异都可能导致同源重组的失败。乳清酸磷酸核糖转移酶(OPRTase)是高山被孢霉合成尿嘧啶合成代谢途径中的关键酶。使编码OPRTase的ura5基因失活，可以获得高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷型菌株。但是，由于ura5基因在细胞生命过程中具有极其重要的地位，导致了真核细胞的自我防御与修复机制作用十分敏感。用基因敲除的方法靶向失活ura5基因构建丝状真菌的尿嘧啶营养缺陷型菌株，在国际上一直未有公开报道的成功先例。难以被转化是丝状真菌基因操作系统远远落后于与其他物种的重要原因之一。在国内一直未见对高山被孢霉遗传操作的先例。根癌农杆菌介导的转化方法已经被越来越多的应用到丝状真菌中，和其它转化方法相比具有四个优点:一、受体细胞可以是孢子或菌丝，不需制备原生质体。二、选择具有单核的孢子作为受体时可避免菌丝的多核所造成的转化子不稳定的问题。三、该方法利用天然的转化载体系统，转化效率高，成功率高，载体可容纳大片段的异源DNA，且基本上为单拷贝插入。四、该方法可以提高同源重组效率。因此，通过根癌农杆菌的转化为高山被孢霉ura5基因靶向失活提供了有效操作手段。高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷型菌株为这种重要的PUFAs生产菌株的基因操作提供了先决条件。这种营养缺陷性菌株既可用于对产油真菌脂肪酸合成与积累的理论研究，也可用于基因工程改造，具有成为PUFAs超级工业生产菌株的潜力。【
技术实现思路
】本专利技术要解决的技术问题是提供一种高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷型菌株。所述营养缺陷型菌株是通过同源重组的方法祀向缺失Mortierella alpina ATCC32222ura5基因(654bp)中的213bp_230bp共18bp的序列实现的。所述同源重组的同源臂DNA序列来源于Mortierella alpina ATCC32222基因组(DDBJ/EMBL/GenBank accession ADAG00000000, first version ADAGO1000000)中，ura5基因上游1393bp (-1180至+212)和下游1362bp (+231至+1592)的片段。本专利技术还提供了一种构建高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷型菌株的方法，所述方法包括获得ura5敲除基因片段，并利用ura5敲除基因片段进一步构建敲除质粒pBIG4K0ura5。然后用重组质粒pBIG4K0ura5转化根癌农杆菌，最后用经转化的含质粒pBIG4K0ura5的根癌农杆菌转化高山被孢霉并对转化后的高山被孢霉进行筛选和鉴定，获得尿嘧啶营养缺陷型菌株。具体步骤如图1，用PCR的方法获得质粒pBluescriptIISK+的MCS基因片段。用限制性内切酶NheI和MunI，EcoRI和XbaI分别对MCS基因片段和质粒pBIG2RHPH2进行酶切，并通过连接反应将MCS基因片段插入质粒pBIG2RHPH2的EcoRI和XbaI位点之间得到质粒PBIG4。用融合PCR的方法获得并连接ura5基因的上下游序列，得到敲除基因片段。用限制性内切酶EcoRI和KpnI对敲除基因片段和质粒pBIG4进行酶切，并通过连接反应将敲除基因片段插入质粒PBIG4，得到重组质粒pBIG4K0ura5。将重组质粒pBIG4K0ura5转化根癌农杆菌C58C1。借助 根癌农杆菌C58C1介导的基因同源重组打断ura5基因，经过筛选鉴定得到高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷型菌株。具体地，本专利技术提供一种高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷型菌株，该菌株是通过失活MortierellaalpinaATCC32222基因组中编码乳清酸磷酸核糖转移酶OPRTase的ura5基因构建而成的。根据一种优选的实施方式，ura5基因的失活是通过缺失654bp的ura5基因中的213bp-230bp共18bp的序列而实现的。本专利技术还提供一种制备权利要求1或2所述的高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷型菌株的方法,通过同源重组使高山被孢霉ura5基因中的213bp-230bp共18bp序列缺失从而使ura5基因失活，所使用的同源臂分别是ura5基因上游-1180至+212的1393bp和下游+231至+1592的1362bp的片段，具体步骤为:首先获得ura5敲除基因片段，并进一步构建敲除质粒pBIG4K0ura5，然后用重组质粒pBIG4K0ura5转化根癌农杆菌，最后用经转化的含质粒 pBIG4K0ura5 的根癌土壤杆菌 Agrobacterium tumefaciensC58Cl-pBIG4K0ura5(CGMCCN0.7730)转化高山被孢霉并对转化后的高山被孢霉进行筛选和鉴定，获得尿嘧啶营养缺陷型菌株。其中所使用的根癌农杆菌为:Agrobacterium tumefaciensC58Cl。此菌株获赠于日本京都县立大学YasuyukiKubo教授。基因敲除使用的根癌农杆菌起始载体为:pBIG本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷型菌株，其特征在于该菌株是通过失活Mortierella?alpinaATCC32222基因组中编码乳清酸磷酸核糖转移酶OPRTase的ura5基因构建而成的。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陈卫，郝光飞，陈永泉，陈海琴，黄小云，杜凯，赵山山，张灏，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：