本发明专利技术涉及一株利用桔皮粉发酵产果胶酶制剂的菌株及利用表面活性剂提高其酶活的方法。本发明专利技术以日本曲霉（Aspergillusjaponicus）PJ01生产果胶酶制剂，制备所得果胶酶制剂活力以果胶酶活力、纤维素酶活力和半纤维素酶活力表征，果胶酶制剂的生产以粉碎的桔皮粉为唯一碳源，加入查氏培养基中的无机营养盐，然后在液态发酵黑曲霉的培养基中添加0.1-0.5%（wt）的PEG4000，经过3-5天摇床培养，外切果胶酶活力（Exo-Pectinase），纤维素酶活力（以CMCase酶计）和半纤维素酶活力（以木聚糖酶Xylanase计）较对照有明显提高。此方法简单，能够明显提高曲霉产果胶酶制剂的能力，而且具有环境友好的特点，因此具有较好的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术涉及一株利用桔皮粉发酵产果胶酶制剂的菌株及利用表面活性剂提高其酶活的方法。本专利技术以日本曲霉（Aspergillusjaponicus）PJ01生产果胶酶制剂，制备所得果胶酶制剂活力以果胶酶活力、纤维素酶活力和半纤维素酶活力表征，果胶酶制剂的生产以粉碎的桔皮粉为唯一碳源，加入查氏培养基中的无机营养盐，然后在液态发酵黑曲霉的培养基中添加0.1-0.5%（wt）的PEG4000，经过3-5天摇床培养，外切果胶酶活力（Exo-Pectinase），纤维素酶活力（以CMCase酶计）和半纤维素酶活力（以木聚糖酶Xylanase计）较对照有明显提高。此方法简单，能够明显提高曲霉产果胶酶制剂的能力，而且具有环境友好的特点，因此具有较好的应用前景。【专利说明】—株产果胶酶制剂的日本曲霉(Aspergi I Iusjaponicus)PJ01及产酶方法
本专利技术涉及产果胶酶制剂的菌株及提高其酶活的产酶方法，具体涉及一株利用桔皮粉发酵产果胶酶制剂的菌株及利用表面活性剂提高其酶活的产酶方法。
技术介绍
柑橘加工过程中，会产生大量的果汁、精油和其他副产物，其中橘皮是一种主要的固体副产物，大约占果实鲜重的50%，与此同时，新鲜橘皮被加工厂当做垃圾废弃而对环境造成很大压力。以中国为例，全国每年产生皮渣在500万t以上，仅湖南省柑橘皮渣产量高达65万t。因此如何利用这些“垃圾”，开发成系列高附加值产品迫在眉睫。橘皮的化学成分中果胶16.0%,纤维素22.5%,半纤维素6.0%,木质素8.6%,因此可以作为微生物降解产酶制剂的优良底物，制备的富含果胶酶、纤维素酶和半纤维素酶的酶制剂。可以用于果汁提取及澄清，植物韧皮组织的脱胶，提取柑橘皮中的柠檬油，提高红酒的色度和稳定性，动物饲料等领域。另外，可用于生物酶法脱除柑橘囊衣，生物酶法脱囊衣是一种生产效率高、产品质量稳定、安全性高、不污染环境的柑橘罐头脱囊衣新技术。近年来,单菌或混菌发酵产复合多酶(enzyme cocktail)的研究受到越来越多的关注。对于碳源选择，Olsson、Botella等人发现霉菌发酵木质素碳源、葡萄皮洛和玉米芯等生物质都能够产生纤维素酶、果胶酶和半纤维素酶等复合多酶。国内专利大多利用麸皮、秸杆、甜菜渣、苹果渣等为复合碳源制备酶制剂，利用桔皮粉作为唯一碳源制备酶制剂还未见报道。黑曲霉(Aspergi llusniger)作为生产宿主通常认为是安全的(GRAS),而且能在合理的时间内产酶，因此成为生产酶制剂的一种非常重要的菌种。但从公开报道的文献中可以看出，对于其产果胶酶、纤维素酶和半纤维素酶的研究大多集中在菌种筛选、鉴定及发酵条件的优化上面。但是用于酶制剂的生产，其酶活力水平仍然不够高，因此亟待找到限制其产酶能力的外部因素并优化其培养条件。众所周知，诸如曲霉、木霉等真菌在降解植物细胞壁时产生胞外酶，因此分泌胞外酶与细胞通透性有直接关系，Tangnu等人发现合适浓度的Tween-80能够促进木霉分泌纤维素酶、半纤维素酶和β -葡萄糖苷酶的能力，曾光明等人通过在绿色木霉发酵纤维素的培养基中添加鼠李糖脂显著提高其酶活力，Callow等人发现鼠李糖脂和Triton X-100能够促进里氏木霉产纤维素酶的能力，但是利用表面活性剂促进桔皮粉的降解产酶却是一个空白。因此，利用一种价格低廉，低毒性环境友好的表面活性剂进行生物发酵桔皮粉生产酶制剂具有良好开发前景。
技术实现思路
本专利技术目的之一在于提供一株利用桔皮粉发酵产果胶酶制剂的日本曲霉(Aspergillus japonicus)PJ01。本专利技术涉及的日本曲霉菌株已于2013年7月9日提交保藏。保藏单位为中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCCNO:M2013323，分类命名为日本曲霉 PJOlAspergillus japonicus PJOl0日本曲霉(Aspergillusjaponicus)PJOl的形态特征:PDA平板上35°C培养I天为白色菌丝，培养2天形成黑色产孢区，培养4天后菌落直径为50-60mm(图4);分生孢子梗长l-3mm,直径20-30 μ m，透明；分生孢子球型，褐黑色，直径40-60 μ m ;孢子直径约为4-6 μ m，圆形。本专利技术所提供的日本曲霉(Aspergillusjaponicus) PJOl可用于制备果胶酶制剂，酶制剂中含果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶等复合酶活力。日本曲霉(Aspergillusjaponicus)PJOl能够在桔皮粉为唯一碳源的液体培养基上生长产酶,发酵工艺简单可行，生长产酶迅速，橘皮废弃物利用充分，产品附加值高等特点。本专利技术目的之二在于提供一种上述的日本曲霉(Aspergillusjaponicus) PJOl发酵来提高所产复合酶酶活的方法。I)斜面培养:将日本曲霉(Aspergillusjaponicus) PJOl抱子接种至PDA斜面培养基上，34-36 °C培养3-5天，待孢子成熟后保藏至4°C ；2)菌悬液制备:用含质量百分比0.02-0.1%的吐温-80的生理盐水洗下PDA斜面培养基曲霉孢子，制成孢子悬液；3)发酵培养:柑橘皮50-60°C烘干，粉碎过10-20目筛；配制查氏培养基盐溶液，250mL三角瓶装液量50-100mL，加入质量百分比1_3%的桔皮粉，质量百分比0.1-0.5%的表面活性剂PEG4000 ;121°C高压灭菌15_25min，接种孢子悬液至1 X 105-1 X 106个孢子/mL，恒温摇床中培养48-72h，温度34-36°C，自然pH，转速150_180r/min。本专利技术采用的查氏培养基盐溶液配方(g/L):NaN033-5, K2HPO3I, KC10.5，MgSO4.7Η200.5，FeSO4.7Η200.01。本专利技术表面活 性剂的选择:250mL三角瓶装液量50_100mL，添加不同表面活性剂Tween-20、Tween-80、PEG4000、PEG6000、Triton X-100 及洗衣粉 0.3% (wt)。121?高压灭菌15-25min，接种曲霉孢子悬液浓度至I X IO5-1 X IO6个/mL，恒温摇床中培养48_72h，温度34-36°C，自然pH，转速150-180r/min。由于桔皮粉中果胶成分含量比重最大，因此选定果胶酶活力较对照增加最大的PEG4000进一步实验(图1)。本专利技术表面活性剂PEG4000的最适浓度选择:添加0.1-0.9%(wt)浓度的PEG4000，利用DNS法测定果胶酶活力(图2)、纤维素酶活力和半纤维素酶活力(图3)。本专利技术酶液提取方法:将发酵获得的产物用8000r/min离心10_15min去除固形物，上清液即为酶液，采用DNS法测定果胶酶活力、纤维素酶活力和半纤维素酶活力。酶活力分析方法:a、果胶酶活力测定:取适当缓冲液稀释的酶液0.5mL加入1.5mL0.5% (W/V)的果胶溶液(此溶液由pH=5.0，浓度0.1M乙酸缓冲液配置)于25mL具塞试管中，45°C反应IOmin后加入2mL DNS终止反应，沸水浴5min，流水冷却，用蒸馏水补充水分至刻度，540nm处测定吸光值。空白对照为在加入酶液前本文档来自技高网...
【技术保护点】
一株产果胶酶制剂的日本曲霉（Aspergillusjaponicus）PJ01，其保藏编号为CCTCC?NO：M2013323。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：单杨，夏金兰，李培骏，高奇瑞，张闯，聂珍媛，李高阳，付复华，
申请(专利权)人：湖南省农产品加工研究所，中南大学，
类型：发明
国别省市：
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