一种高产延胡索酸米根霉工程菌及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种高产延胡索酸米根霉及其应用，属于遗传工程领域。本发明专利技术采用代谢工程手段，将来源于酿酒酵母(Saccharomyces?cerevisiae)中编码丙酮酸羧化酶的基因ScPYC1过量表达于发酵法生产延胡索酸的菌株Rhizopus?delemar?NRRL1526中，获得了一株丙酮酸羧化酶活性提高的重组菌R.delemar-pRS303H-PC，其丙酮酸羧化酶活性提高了5.4倍(达到4.59U/mg?protein)；以葡萄糖为唯一碳源，发酵72h后，延胡索酸产量达到55.92g/L，是出发菌株的1.19倍，具有广阔的应用前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种高产延胡索酸米根霉，特别是一种通过代谢工程手段过量表达ScPYCl基因提高胞内丙酮酸羧化酶活性来强化三羧酸循环的回补途径，从而调控碳代谢流从丙酮酸进入TCA还原途径，实现延胡索酸过量积累的方法。
技术介绍
延胡索酸(fumaric acid)是一种重要的二元羧酸,广泛用于树酯合成、食品添加齐U、饲料添加剂、医药、航空材料等工业生产中。米根霉(Rhizopus deIemar)作为大量积累延胡索酸的主要微生物之一，广泛用于有机酸、酶、抗体、低胆固醇的生产。R. delemar胞内存在TCA氧化途径及胞液中TCA还原途径。丙酮酸在丙酮酸羧化酶作用下，与CO2相互作用形成草酰乙酸。同时，作为TCA氧化途径中间代谢产物的草酰乙酸，在菌体生长过程中作为前体物质用于菌体物质的合成。当微生物生长环境中氮源成为菌体生长的限制条件时， 菌体停止生长，葡萄糖代谢过程中的CO2固定途径仍然继续作用，此时C4化合物积累。在非菌体生长时期，Imol葡萄糖分解代谢,在丙酮酸羧化酶作用下固定2mol CO2,形成2mol延胡索酸。然而，如果米根霉菌体代谢只有TCA还原途径，则无法合成供物质运输本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高产延胡索酸米根霉(Rhizopus?delemar)，其特征在于过量表达外源丙酮酸羧化酶基因，所述丙酮酸羧化酶基因核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种高产延胡索酸米根霉(Rhizopus delemar),其特征在于过量表达外源丙酮酸羧化酶基因，所述丙酮酸羧化酶基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.根据权利要求1所述米根霉的构建方法，其特征在于包括如下步骤1)根据米根霉(R.delemar)胞内蛋白的表达与启动子直接相关，而与拷贝数无关，以NCBI公布的Rhizopus oryzae AF282846、AF282847，采用化学全合成方法分别获得丙酮酸脱羧酶基因的启动子与终止子片段；2)以NCBI公布的匪001180927.1序列，采用化学全合成方法合成丙酮酸羧化酶基因编码区；3)将步骤I)和2)得到的三段片段进行融合，形成完整的丙酮酸羧化酶基因表达框；4)将步骤3)获得的表达框克隆到PRS303H载体，转化米根霉悬浮孢子后得到重组菌。3.根据权利要求2所述的方法，其特征是所述转化在1000疒10000V的电场强度下进行。4.权利要求1所述米根...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈坚，周景文，周正雄，堵国成，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：