高青蒿素含量转基因青蒿植株的生产方法技术

本发明专利技术涉及一种生物技术领域的高青蒿素含量转基因青蒿植株的生产方法，包括如下步骤：从青蒿中克隆ADS，CYP71AV1和CPR三个基因，构建含ADS，CYP71AV1和CPR三基因的植物表达载体，用根癌农杆菌介导，将ADS，CYP71AV1和CPR三基因转入青蒿并再生出植株，筛选，获得青蒿素含量提高的转基因青蒿植株。在非转化普通青蒿含量为6.43mg/g?DW时，本发明专利技术得到的转基因青蒿株系中青蒿素的含量最高达到15.09mg/g?DW，其含量是非转化青蒿含量的2.35倍，本发明专利技术的方法对于为青蒿素的规模化生产提供高产、稳定新药源具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及的是一种生物
的提高青蒿素含量的方法，特别是涉及一种。
技术介绍
青蒿(Artemisia annua L.)是菊科蒿属的一年生草本植物。青蒿素(artemisinin)是从其地上部分分离的一种含有过氧桥结构的倍半職内酯化合物,是目前世界上公认的最有效的治疗疟疾的药物，特别是对于脑型疟疾和抗氯喹疟疾具有速效和低毒的特点。目前，世界卫生组织推荐的最有效的治疗疟疾的方法就是青蒿素联合疗法(ACTs)。另外，随着对青蒿素药理研究的逐步深入，科学家发现青蒿素及其衍生物还具有抗炎、抗血吸虫、抗肿瘤以及免疫调节的功能，可见青蒿素是一种极具潜力的天然药物。 目前青蒿素的主要来源是从青蒿植株的地上部分提取，然而青蒿中青蒿素的含量非常低，使得这种药物的大规模商业化生产受到了限制。由于青蒿素结构复杂，人工合成难度大，产量低，成本高，不具有可行性。有人尝试用组织培养和细胞工程的方法来生产青蒿素，然而青蒿素在愈伤组织中含量低于干重的0. 1%，在芽中最高也只有干重的0. 16%，而大多数研究在根中没有检测到青蒿素。因此利用组织培养及细胞工程来生产青蒿素的可行性也不高。经对现有技术文献检索发现，Pravej Alam等在2011年的《Plant Cell Rep》(《植物细胞报道》)发表了题为 “Over-expression of HMG-CoA reductase and amorpha-4,11-dienesynthase genes in Artemisia annua Land its influence on artemisinincontent^ “在青蒿中过表达HMGR和ADS基因对青蒿素含量的影响”)的论文，报道通过共同转化青蒿素合成途径关键酶基因HMGR和ADS，得到的转基因植株青蒿素含量得到明显提高的转基因株系。通过基因工程方法提高青蒿植株中青蒿素的含量为规模化生产青蒿素提供一条新途径。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种。在非转化普通青蒿含量为6. 43mg/g DW时，本专利技术得到的转基因青蒿株系中青蒿素的含量最高达到15. 09mg/g DW，其含量是非转化青蒿含量的2. 35倍，本专利技术的方法对于为青蒿素的规模化生产提供高产、稳定新药源具有重要意义。本专利技术是通过以下的技术方案实现的，本专利技术涉及一种，包括如下步骤从青蒿中克隆ADS，CYP71AV1和CPR三个基因，构建含ADS, CYP71AV1和CPR三基因的植物表达载体，用根癌农杆菌介导，将ADS，CYP71AV1和CPR三基因转入青蒿并再生出植株，筛选，获得青蒿素含量提高的转基因青蒿植株。优选地，所述筛选包括如下步骤PCR检测外源目的基因ADS，CYP71AV1和CPR基因的整合情况，高效液相色谱法及蒸发光散射检测器测定转基因青蒿中青蒿素的含量。优选地，所述PCR检测为设计合成35S和ADS，CYP71AV1和CPR基因的引物，进行DNA扩增，紫外线下观察到目的条带的株系即为转基因青蒿植株。优选地，所述高效液相色谱法及蒸发光散射检测器测定青蒿植株中青蒿素含量，测定条件为色谱柱C-18反相硅胶柱，流动相为甲醇水，甲醇水的体积比为70 30，柱温30°C，流速I. OmL/min,进样量10 u L，蒸发光散射检测器漂移管温度40°C，放大系数为7，载气压力5bar。本专利技术具有如下的有益效果本专利技术的共转ADS，CYP71AV1和CPR三基因提高青蒿中青蒿素含量的方法，采用基因工程方法，将关键酶基因ADS，CYP71AV1和CPR三基因导入青蒿植株中，获得了青蒿素含量显著提高的转基因青蒿株系，在非转化普通青蒿含量为6. 43mg/g DW时，共转ADS，CYP71AV1和CPR三基因青蒿中青蒿素的含量最高达到15. 09mg/g DW，其含量是非转化青蒿含量的2. 35倍，该专利技术对于为青蒿素的规模化生产提供高产、稳定新药源具有重要意义。附图说明 图I为植物双元表达载体pCAMBIA2300-cyp71avl-cpr_ads的构建示意图；图2为实施例中转基因青蒿植株的PCR检测结果图；图3为实施例中青蒿植株中青蒿素的含量检测结果图。具体实施例方式下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆实验室手册(New York Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。对本专利技术的过程概述如下(I)采用基因克隆方法获得青蒿关键酶基因ADS，CYP71AV1和CPR ；(2)把ADS，CYP71AV1和CPR三基因可操作性地连接于表达调控序列，形成含ADS，CYP71AV1和CPR三基因的植物表达载体；(3)将含ADS，CYP71AV1和CPR三基因的植物表达载体转化根癌农杆菌，获得用于转化青蒿的含ADS，CYP71AV1和CPR三基因植物表达载体的根癌农杆菌菌株；(4)利用所构建的根癌农杆菌菌株转化青蒿，获得经PCR检测的转基因青蒿植株；(5)对获得的转基因青蒿中青蒿素含量进行HPLC-ELSD测定，筛选获得青蒿素含量显著提高的转基因青蒿植株。实施例I、青蒿ADS, CYP71AV1和CPR三基因的克降I. I青蒿基因组总RNA的提取取青蒿叶片组织，置于液氮中研碎，加入盛有裂解液的I. 5mL Eppendorf(EP)离心管中，充分振荡后，按照TIANGEN试剂盒的说明书抽提总RNA。用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量，然后在分光光度计上测定RNA含量。I. 2青蒿ADS，CYP71AV1和CPR三基因的克隆将所获的青蒿基因组总RNA通过反转录酶XL (AMV)反转录获得第一链cDNA，根据所述青蒿ADS，CYP7IAVl和CPR三基因的编码序列(分别如SEQ ID NO. USEQ ID NO. 2、SEQID NO. 3所示)，设计扩增出完整编码框的上下游引物，并在上游和下游引物上分别引入限制性内切酶位点，以便构建表达载体。以所述的第一链cDNA为模板，经PCR扩增后进行测序。DNA序列测定由上海英骏生物技术服务有限公司采用3730自动测序仪完成。测序结果表明，所克隆的序列与GenBank中所报道的青蒿ADS，CYP71AV1和CPR三基因的编码序列一致。本实施例采用基因克隆方法从青蒿中获得序列正确的青蒿素生物合成关键酶基因ADS，CYP71AV1和CPR，为通过共转ADS，CYP71AV1和CPR三基因提高青蒿中青蒿素含量提供了重要的关键酶基因。实施例2、含ADS, CYP71AV1和CPR三某闵的棺物双元表汰载体的构律2. I 中间载体 pMDl8_p35S-gfp-gus-nos 的构建 选用pMD18-T和pCAMBIA1304为基本元件，构建中间载体pMD18-p35S-gfp-gus_nos。具体地，根据 pCAMBIA1304 上 p35S-gfp-gus_nos 的序列设计一对引物，并在上游和下游引物上分别引入限制性内切酶位点，以便构建表达载体。以PCAMBIA1304质粒为模版，PCR扩增gfp-gus融合基因的表达盒，连接到pMD18_T载体，转化筛选，挑取单克隆本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高青蒿素含量转基因青蒿植株的生产方法，其特征在于，包括如下步骤：从青蒿中克隆ADS，CYP71AV1和CPR三个基因，构建含ADS，CYP71AV1和CPR三基因的植物表达载体，用根癌农杆菌介导，将ADS，CYP71AV1和CPR三基因转入青蒿并再生出植株，筛选，获得青蒿素含量提高的转基因青蒿植株。

【技术特征摘要】
1.一种高青蒿素含量转基因青蒿植株的生产方法，其特征在于，包括如下步骤从青蒿中克隆ADS，CYP71AV1和CPR三个基因，构建含ADS，CYP71AV1和CPR三基因的植物表达载体，用根癌农杆菌介导，将ADS，CYP71AV1和CPR三基因转入青蒿并再生出植株，筛选，获得青蒿素含量提高的转基因青蒿植株。2.如权利要求I所述的高青蒿素含量转基因青蒿植株的生产方法，其特征在于，所述筛选包括如下步骤PCR检测外源目的基因ADS，CYP71AV1和CPR三基因的整合情况，高效液相色谱法及蒸发光散射检测器测定转基因青蒿中青蒿素的含量。3.如权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐克轩，陆续，张凌，沈乾，高尔娣，江伟民，张芳源，吕宗友，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：