用于甲硫氨酸生产的菌株和方法技术

本发明专利技术涉及使用具有苏氨酸的减弱转化的修饰菌株用于甲硫氨酸生产的方法。这可以通过减少苏氨酸转化成甘氨酸和/或通过减少其转化至α-酮丁酸来实现。本发明专利技术还涉及具有苏氨酸的减弱转化的修饰菌株。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及使用具有苏氨酸的减弱转化的修饰菌株用于甲硫氨酸生产的方法。这可以通过减少苏氨酸降解成甘氨酸，和/或通过减少其转化成a-酮丁酸来实现。本专利技术还涉及具有苏氨酸的减弱转化的修饰菌株。
技术介绍
含硫化合物例如半胱氨酸、高半胱氨酸、甲硫氨酸或S-腺苷甲硫氨酸对于细胞代谢是关键的，并且工业生产以用作食物或饲料添加剂和药剂。特别地，不能由动物合成的必需氨基酸甲硫氨酸在许多机体功能中起重要作用。除其在蛋白质生物合成中的作用外，甲硫氨酸涉及转甲基作用以及硒和锌的生物利用度。甲硫氨酸还直接用作治疗用于病症如变态反应和风湿热。然而，生产的大多数甲硫氨酸加入动物饲料中。由于BSE和鸡流感，动物衍生的蛋白质的使用减少，随之而来的是对于纯甲硫氨 酸的需求增加。在化学上，D，L-甲硫氨酸通常由丙烯醛、甲硫醇和氰化氢产生。然而，夕卜消旋混合物不如纯L-甲硫氨酸一样表现良好,如例如在鸡饲料添加剂中(Saunderson,C. L. , (1985)British Journal of Nutrition 54,621-633)。纯 L-甲硫氨酸可以例如通过N-乙酰-D，L-甲硫氨酸的酰基酶处理自外消旋甲硫氨酸产生，这急剧增加生产成本。对于与环境问题相关的纯L-甲硫氨酸的渐增需求使甲硫氨酸的微生物生产变得有吸引力。甲硫氨酸生物合成依赖于高丝氨酸、半胱氨酸和Cl单位生产。高丝氨酸是天冬氨酸的衍生物并且提供用于甲硫氨酸的碳骨架。高丝氨酸还可以转化成苏氨酸，这继而又是(i)异亮氨酸的前体且还可以转化成甘氨酸(ii)。这两个反应消耗苏氨酸且将更多高丝氨酸拉进苏氨酸途径，从而减少进入甲硫氨酸途径的流量。(i)对于异亮氨酸的生产，苏氨酸脱氨为a-酮丁酸，通过分别由基因ilvA(EC4. 3. I. 19, Ramakrishnan 等人，1965, J Bacteriol, 89:661)和 tdcB (EC 4. 3. I. 19, Goss 等人，1988，J Bacteriol，170:5352)编码的苏氨酸脱氨酶或苏氨酸脱水酶催化的反应。由sdaA (EC 4. 3. I. 17 ；Su 等人 1989，J Bacteriol, 171:5095)和 sdaB (EC 4. 3. I. 17，Su 和Newman, 1991，173:2473)编码的丝氨酸脱氨酶也已知编码某些苏氨酸脱氨酶活性。(ii)两种用于苏氨酸甘氨酸转化的途径存在于大肠杆菌(E. coli.)中(A)苏氨酸可以通过由苏氨酸脱氢酶(Tdh ;E. C. I. I. I. 103)和2_氨基3_酮丁酸-coA-裂解酶(Kbl ;E. C. 2. 3. I. 29) (Boylan S. A.等人，1981，Journal of BiologicalChemistry, 256, 4,第 1809-1815 页；Mukher jee J. J.等人，1987, Journal of BiologicalChemistry, 262, 30,第14441-14447页)催化的两个连续反应转化成甘氨酸。这些反应各生成一分子的乙酸-coA和NADH。(Komatsubara S.等人，1978, Journal ofBacteriology, 1981，135，第 318-323 页)。(B)苏氨酸还可以经由通过苏氨酸醛缩酶催化的反醛醇(retooaldol)机制直接转化成甘氨酸。这种反应生成一个乙醒和一个甘氨酸(Plamann M. D.等人，1983, Gene, 22,1,第9_18页)。在大肠杆菌中的苏氨酸醛缩酶活性携带酶由下述基因编码ltaE(Liu JL等人，1998，European Journal of Biochemistry, 255，1，第220-226页)、kbl (Markus J. P.等人，1993，Biochemica et Biophysica Acta, 1164,第 299-304 页)和gkyA (Schirch V.等人，1968，Journal of Biological Chemistry, 243,第 5561 页；SchirchV.等人，1985, Journal of Bacteriology, 163, I,第 1-7 页)。LtaE是低特异性苏氨酸醛缩酶，其被认为涉及苏氨酸的降解，以形成乙醛和甘氨酸(Liu JL 等人，1998, European Journal of Biochemistry, 255, I,第 220_226 页)。Kbl的主要活性是2-氨基-3-酮丁酸CoA连接酶(E. C 2. 3. I. 29)，其由2-氨基-3-酮丁酸的脱乙酰组成，以形成甘氨酸和乙酰-辅酶A(Mukherjee J.J.等人，1987, Journal of Biological Chemistry, 262, 30,第 14441-14447 页)。它已显不具有TAL活性,这使得其成为用于苏氨酸降解的通用酶(Markus J. P.等人，1993，Biochemica etBiophysica Acta, 1164,第 299-304 页)。GlyA的基本活性是丝氨酸羟甲基转移酶(SHMT) (E. C. 2. I. 2. I)。它催化氨基酸丝氨酸和四氢叶酸(THF)转化成甘氨酸和5，10亚甲基-THF(关于综述Schirch V.等人，2005，Current opinion in Chemical biology, 9,第 482-487 页)。在由 GlyA 催化的 其他次级活性中(关于综述Schirch L. , 2006, Advances in enzymology and relatedareas of molecular biology, 53，第83-112页)，仅苏氨酸醒缩酶(TAL)看起来是生理学相关的。GlyA 是结晶的(Scarsdale 等人，2000，Journal of Molecular Biology, 296,第155-168页)，并且已进行了研究以阐明底物特异性的起源(Angelaccio S.等人，1992, Biochemistry, 31,第155-162页)。Angelaccio等人将活性部位附近的所有苏氨酸突变为丙氨酸，并且注意到突变T226A使苏氨酸的Km增加I. 8倍，并且使TAL活性减少至次于其定量限的水平，同时不修饰THF的Km也不修饰丝氨酸的Km。然而，该突变对SHMT活性具有强烈影响，因为SHMT活性的kMt减少了 32倍。经修饰用于改善得率的用于生产甲硫氨酸的菌株目前在本领域中广泛公开。目前理解甲硫氨酸生物合成途径特别地与涉及许多其他途径的基因复合。因此，增强或减弱乍一看对促进甲硫氨酸合成可能有利的基因可能以相反结果结束。已知涉及苏氨酸消耗的基因也已知涉及Cl生产。涉及苏氨酸降解的蛋白质的活性抑制或表达减弱已在几项工作中公开。Simic等人(Simic 等人，2002，Applied and Environmental microbiology, 68 (7),第 3321-3327页)公开GlyA蛋白的苏氨酸活性的醛醇(aldole本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2009.12.30 EP 09306349.3;2009.12.30 US 61/290,9751.一种用于在发酵工艺中生产甲硫氨酸、其前体或衍生物的方法，其包括如下步骤 -在包含碳源、硫源和氮源的合适培养基中培养经修饰的微生物，和 -从所述培养基中回收甲硫氨酸和/或其衍生物， 其中所述微生物是以减少苏氨酸转化为除甲硫氨酸外的其他化合物的方式修饰的。2.权利要求I的方法，其中自苏氨酸的甘氨酸产生是减少的。3.权利要求2的方法，其中将苏氨酸转化为甘氨酸的酶的活性是减少的。4.权利要求3的方法,其中至少一种下述基因的表达是减弱的ltaE、kbl、glyA、tdh。5.权利要求4的方法，其中表达突变型GlyA酶，其具有减弱的苏氨酸醛缩酶活性，同时维持所述酶GlyA的丝氨酸羟甲基转移酶活性。6.权利要求5的方法，其中所述GlyA酶具有在其多肽序列中的至少一种下述氨基酸变化T128S、T224S、T225S、T226S、T227S、T230S、R235K。7.根据权利要求4-6中任一项的方...

【专利技术属性】
技术研发人员：C波伊萨特，G贝斯特尔科尔，G巴比尔，R菲格，
申请(专利权)人：代谢探索者公司，
类型：发明
国别省市：