增加甲硫氨酸得率制造技术

本发明专利技术涉及增加甲硫氨酸得率，具体地涉及通过在包含碳源和硫源的适当培养基中培养微生物来生产甲硫氨酸或其衍生物的方法。该微生物和/或该培养基经修饰，使得甲硫氨酸/碳源得率增加。本发明专利技术也描述了从发酵培养基中分离甲硫氨酸或其衍生物。

【技术实现步骤摘要】
增加甲硫氨酸得率本申请是申请日为2008年9月25日，申请号为“200880110059.9”(国际申请号为“PCT/EP2008/062859”)，名称为“增加甲硫氨酸得率”的专利技术专利申请的分案申请。
本专利技术涉及一种通过在包含碳源和硫源的适宜培养基中培养微生物来生产甲硫氨酸及其衍生物的方法。该微生物和/或该培养基经修饰使得其甲硫氨酸/碳源得率增加。本专利技术还要求保护从发酵培养基中分离甲硫氨酸及其衍生物。
技术介绍
含硫化合物如半胱氨酸、高半胱氨酸、甲硫氨酸或S-腺苷甲硫氨酸对细胞代谢是关键的，并工业上生产用作食物或饲料添加剂以及药物。尤其甲硫氨酸是一种动物无法合成的必需氨基酸，在许多身体功能中起着重要作用。除了它在蛋白质生物合成中的作用，甲硫氨酸也涉及转甲基作用，以及硒与锌的生物利用。甲硫氨酸还直接用作对于病症如过敏与风湿热的治疗。然而，大部分生产出的甲硫氨酸添加于动物饲料。随着动物来源的蛋白质因BSE与禽流感(chickenflu)的缘故而减少使用，对纯甲硫氨酸的需求增加。D,L-甲硫氨酸通常自丙烯醛、甲硫醇以及氰化氢通过化学方法产生。然而，该外消旋混合物的性能并不像纯L-甲硫氨酸一样好，例如在鸡饲料添加剂中(Saunderson,C.L.,(1985)BritishJournalofNutrition54,621-633)。纯L-甲硫氨酸可自外消旋甲硫氨酸产生，例如通过酰基酶处理N-乙酰-D,L-甲硫氨酸来进行。这极大地提高了生产成本。对纯L-甲硫氨酸需求增加，连同对环境的考虑，使甲硫氨酸的微生物生产具有吸引力。微生物发展出高度复杂的调控机制来调整细胞组分的生物合成，从而允许最大生长速率。结果，仅仅必需量的代谢物如氨基酸被合成，通常无法在野生型菌株的培养物上清中检测到。细菌主要通过酶的反馈抑制及基因转录的阻抑或激活来控制氨基酸生物合成。在大部分情况下，这些调控途径的效应物是相关途径的终产物。因此，在微生物中过量生产氨基酸的策略要求对这些控制机制解除调控。在许多微生物中L-甲硫氨酸合成途径众所周知(图1)。甲硫氨酸衍生自氨基酸天冬氨酸，但是其合成需要另外两条途径的合流(convergence)，即半胱氨酸生物合成与C1代谢。天冬氨酸自草酰乙酸合成。在大肠杆菌(E.coli)中，稳定的草酰乙酸储备(pool)是柠檬酸循环的正常发挥功能所需的。因此将草酰乙酸转化为天冬氨酸需要对从该储备中移出草酰乙酸进行补偿的反应。数种称为添补反应(anapleroticreaction)的途径，在大肠杆菌中实现了这些功能(Sauer&Eikmanns(2005)FEMSMicrobiolReviews29p76-94)。在指数生长条件及葡萄糖过剩的情况下，PEP羧化酶催化PEP的羧化产生草酰乙酸。羧化的效率取决于胞内PEP浓度及其他。PEP是参与多种反应的中心代谢物。这些反应之一，PEP糖酵解转化为丙酮酸对大肠杆菌不是必需的，因为葡萄糖通过PTS系统摄入可将产自葡萄糖的两个PEP分子之一转化为丙酮酸。在糖酵解中，酶丙酮酸激酶(其在大肠杆菌由基因pykA和pykF编码的两个同工酶编码)催化PEP转化为丙酮酸。天冬氨酸通过顺序的三个反应转化为高丝氨酸。高丝氨酸可随后进入苏氨酸/异亮氨酸或甲硫氨酸生物合成途径。在大肠杆菌中，进入甲硫氨酸途径需要将高丝氨酸酰化为琥珀酰高丝氨酸。这个激活步骤允许随后与半胱氨酸缩合，生成含有硫醚的胱硫醚。胱硫醚水解生成高半胱氨酸。生成甲硫氨酸的最后甲基转移通过B12-依赖或B12-非依赖的甲基转移酶进行。在大肠杆菌中，甲硫氨酸生物合成通过阻抑和激活甲硫氨酸生物合成基因分别经由MetJ和MetR的蛋白来调控(在FiggeRM(2006),WendischVF编,MicrobiolMonogr(5)Aminoacidbiosynthesisp164-185的综述)。已知MetJ连同其共阻抑物S-腺苷甲硫氨酸调控基因metA、metB、metC、metE和metF。MetR在其共激活子高半胱氨酸的存在下激活编码涉及甲硫氨酸生成的酶的其它基因，如glyA、metE、metH和metF，而metA仅在高半胱氨酸不存在时被MetR激活。所有这些酶参与C1单元的产生及其从丝氨酸到甲硫氨酸的转移。编码丝氨酸羟甲基转移酶的GlyA催化丝氨酸到甘氨酸的转化，以及C1单元在辅酶四氢叶酸(THF)上的伴随转移。甘氨酸可随即转化为CO2、NH3，而另一个C1单元转移到THF上。该反应受到由基因gcvTHP和lpd编码的甘氨酸裂解复合物催化。由上述两个反应所产生亚甲基-THF形式的C1单元可随后还原为甲基-THF或进一步氧化为甲酰-THF。甲硫氨酸生物合成需要还原为甲基-THF。因此氧化反应与甲硫氨酸生物合成竞争C1单元。甲酰-THF或甲酸对嘌呤和组氨酸的生物合成是必需的。在大肠杆菌中，在通过由purU基因编码的甲酰基-THF脱甲酰基酶催化的反应中，甲酰-THF可转化为THF及游离的甲酸(Nagy等(1995)J.Bacteriol177(5)p.1292-98)。亚甲基-THF到甲基-THF的还原由MetF蛋白催化。甲基到高半胱氨酸上的转移由MetH通过维生素B12或直接由MetE催化。已知MetH酶的催化速率是MetE酶的一百倍。当缺乏维生素B12因而缺乏活性MetH时，MetE可构成多至5%的总细胞蛋白。活性MetH的存在降低MetE的活性，可能是通过降低通常经由MetR激活metE转录的高半胱氨酸的量来进行。因此，通过MetH产生甲硫氨酸为细胞节约了重要的资源，因为MetE并非大量表达。高半胱氨酸的积累对大肠杆菌是有毒的(Tuite等,2005J.Bacteriol,187,13,4362-4371.)，而且同时对经由MetR的metA表达具有负面的调控效应。因此，显然酶MetH和/或MetE的强表达对有效的甲硫氨酸生成是必需的。在大肠杆菌中，还原的硫整合至半胱氨酸中，并随即转移到甲硫氨酸前体O-琥珀酰-高丝氨酸上，该过程称为转硫化作用(在Neidhardt,F.C.(主编),R.CurtissIII,J.L.Ingraham,E.C.C.Lin,K.B.Low，B.Magasanik,W.S.Reznikoff，M.Riley,M.Schaechter,和H.E.Umbarger(编).1996.EscherichiacoliandSalmonella:CellularandMolecularBiology.AmericanSocietyforMicrobiology中综述)。半胱氨酸通过硫氢化反应由O-乙酰丝氨酸和H2S产生。该过程受到其产物半胱氨酸的负反馈调控，半胱氨酸作用于由cysE编码的丝氨酸转乙酰酶。N-乙酰丝氨酸(其由O-乙酰丝氨酸自发产生)与转录因子CysB一同激活编码参与如下的酶的基因：含硫化合物的运输，它们变为H2S的还原及它们在有机硫化合物半胱氨酸(其与甲硫氨酸一样是必需氨基酸)中的整合。在缺乏半胱氨酸时，MetB催化甲硫氨酸前体O-琥珀酰高丝氨酸转化为氨、α-酮丁酸及琥珀酸，该反应称为γ-消去(Aitken&Kirsch,2005,ArchBiochemBio本文档来自技高网...

【技术保护点】
修饰的微生物，其具有增加的甲硫氨酸/碳源得率，其中基因purU缺失。

【技术特征摘要】
2007.10.02 EP PCT/EP2007/0604331.一种在发酵工艺中产生甲硫氨酸及其衍生物的方法，包括以下步骤：-在包含碳源与硫源的适当培养基中培养来自大肠杆菌的种的经修饰的微生物，和-从所述培养基中回收甲硫氨酸，其中与来自大肠杆菌的种的未修饰的微生物相比，该经修饰的微生物通过缺失基因purU呈现降低的甲酰-THF的脱甲酰化，而且通过在所述培养基中对该经修饰的微生物限制磷酸盐或使其缺乏磷酸盐来限制所述微生物的生长。2.权利要求1的方法，其中还通过PEP消耗的减少修饰该微生物，所述PEP消耗的减少通过削弱pykA基因和/或pykF基因的表达而获得。3.权利要求1的方法，其中通过在所述培养基中对该经修饰的微生物进一步限制钾或使其缺乏钾来限制所述微生物的生长。4.权利要求1的方法，其中通过削弱pykA和/或pykF基因的表达来减少PEP的消耗，而且其中在所述培养基中对该微生物进一步限制钾或使其缺乏钾来限制所述微生物的生长。5.权利要求1-4中任一项的方法，其中在该经修饰的微生物中下列至少一个基因的表达增加：cysP、cysU、cysW、cysA、cysM、cysJ、cysI、cysH、cysE、gcvT、gcvH、gcvP、lpd、serA、serB、serC、glyA。6.权利要求5的方法，其中在该微生物中操纵子cysPUWAM和/或cysJIH的表达增加。7.权利要求5的方法，其中在该微生物中由基因gcvTHP和/或lpd编码的甘氨酸裂解复合物的表达增加。8.权利要求5的方法，其中至少一个涉及甘氨酸生物合成途径的基因过表达。9.权利要求8的方法，其中...

【专利技术属性】
技术研发人员：雷纳菲格，菲利普苏凯勒，吉劳姆巴比尔，格温耐尔贝斯特尔科雷，锡德里克博伊萨特，米歇尔查蒂厄，
申请(专利权)人：代谢探索者公司，
类型：发明
国别省市：