一种重组猪流行性腹泻病毒乳酸乳球菌、其构建方法及应用技术

本发明专利技术公开一种重组猪流行性腹泻病毒乳酸乳球菌、其构建方法及应用，其制备步骤包括：RT-PCR扩增获得猪流行性腹泻病毒（PEDV）主要保护性抗原COE基因序列，并将其克隆测序。根据测序结果和表达载体特点，设计表达引物，扩增PEDV?COE编码序列，并将其连接至乳酸乳球菌表达载体pNZ8149，电转化入乳酸乳球菌NZ3900细胞内从而获得重组菌。将重组菌以1ng/mL乳链菌肽（Nisin）诱导，通过SDS-PAGE和Western?blot分析，PEDV主要S蛋白获得了表达。表达的重组PEDV乳酸菌载体口服疫苗能够刺激小鼠产生体液免疫和一定的细胞免疫，在制备猪流行性腹泻病毒疫苗等药物中具有广泛的应用前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及分子生物学
，具体涉及一种重组猪流行性腹泻病毒乳酸乳球菌、其构建方法及应用。
技术介绍
猪流行性腹湾(Porcine epidemic diarrhea, PED)是由猪流行性腹湾病毒(Porcine epidemicdiarrhea virus, PEDV)引起的以腹湾、呕吐和脱水为特征的猪肠道传染病(Bi et al.2012; Pan etal.2012; Song and Park 2012)。从 2010 年以来，猪流行性腹泻病开始在全国流行，导致仔猪腹泻，甚至死亡，给养猪业造成了严重的损失(毛雅元2010)。目前，传统的猪流行性腹泻疫苗已经不能完全控制疫情的传播和发生。在此情况下，研制新型的猪流行性腹泻疫苗非常必要。PEDV纤突(spike，S )糖蛋白携带主要的B淋巴细胞抗原表位，是诱导机体产生中和抗体和提供免疫保护作用的主要结构蛋白(Duarte and Laude 1994;Chang etal.2002)。实践证明，肠道黏膜免疫所产生的分泌型抗体(slgA)是抵抗PEDV感染的有效抗体。其中，PEDV S糖蛋白中COE基因被证明是主要的抗原保本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组猪流行性腹泻病毒乳酸乳球菌的构建方法，其特征在于，包括步骤有：①利用引物序列SEQ?ID?NO.1~2，对猪流行性腹泻病毒主要保护性抗原COE基因序列进行扩增，将扩增后的产物，连接至pMD?18?T载体中；②以步骤①获得的重组载体为模板，利用引物序列SEQ?ID?NO.3~4进行PCR扩增，将PCR产物经Nco?I与Sac?I酶切、凝胶回收纯化后与经相同酶切、纯化后的载体pNZ8149连接；③将步骤②获得的重组质粒电转化入乳酸乳球菌NZ3900细胞内获得阳性重组菌。

【技术特征摘要】
1.一种重组猪流行性腹泻病毒乳酸乳球菌的构建方法，其特征在于，包括步骤有: ①利用引 物序列SEQID N0.广2，对猪流行性腹泻病毒主要保护性抗原COE基因序列进行扩增，将扩增后的产物，连接至PMD 18-T载体中； ②以步骤①获得的重组载体为模板，利用引物序列SEQID N0.3 4进行PCR扩增，将PCR产物经Nco I与Sac I酶切、凝胶回收纯化后与经相同酶切、纯化后的载体pNZ8149连接； ③将步骤②获得的重组质粒电转化入乳酸乳球菌NZ3900细胞内获得阳性重组菌。2.根据权利要求1所述的重组猪流行性腹泻病毒乳酸乳球菌的构建方法，其特征在于，所述的步骤①中，基因序列扩增条件为:94°C预变性5min，94°C变性lmin，54°C退火lmin, 72°C延伸lmin,共30个循环。3.根据权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：高凤山，
申请(专利权)人：大连大学，
类型：发明
国别省市：