本发明专利技术公开一种重组猪流行性腹泻病毒乳酸乳球菌、其构建方法及应用，其制备步骤包括：RT-PCR扩增获得猪流行性腹泻病毒（PEDV）主要保护性抗原COE基因序列，并将其克隆测序。根据测序结果和表达载体特点，设计表达引物，扩增PEDV?COE编码序列，并将其连接至乳酸乳球菌表达载体pNZ8149，电转化入乳酸乳球菌NZ3900细胞内从而获得重组菌。将重组菌以1ng/mL乳链菌肽（Nisin）诱导，通过SDS-PAGE和Western?blot分析，PEDV主要S蛋白获得了表达。表达的重组PEDV乳酸菌载体口服疫苗能够刺激小鼠产生体液免疫和一定的细胞免疫，在制备猪流行性腹泻病毒疫苗等药物中具有广泛的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物学
，具体涉及一种重组猪流行性腹泻病毒乳酸乳球菌、其构建方法及应用。
技术介绍
猪流行性腹湾(Porcine epidemic diarrhea, PED)是由猪流行性腹湾病毒(Porcine epidemicdiarrhea virus, PEDV)引起的以腹湾、呕吐和脱水为特征的猪肠道传染病(Bi et al.2012; Pan etal.2012; Song and Park 2012)。从 2010 年以来，猪流行性腹泻病开始在全国流行，导致仔猪腹泻，甚至死亡，给养猪业造成了严重的损失(毛雅元2010)。目前，传统的猪流行性腹泻疫苗已经不能完全控制疫情的传播和发生。在此情况下，研制新型的猪流行性腹泻疫苗非常必要。PEDV纤突(spike，S )糖蛋白携带主要的B淋巴细胞抗原表位，是诱导机体产生中和抗体和提供免疫保护作用的主要结构蛋白(Duarte and Laude 1994;Chang etal.2002)。实践证明，肠道黏膜免疫所产生的分泌型抗体(slgA)是抵抗PEDV感染的有效抗体。其中，PEDV S糖蛋白中COE基因被证明是主要的抗原保护性基因(Kang et al.2005)。乳酸乳球菌(Lactococcus Iactis)是一种易通过黏膜吸收的常在菌，适量的乳酸菌对维持肠道菌群平衡具有积极意义。NIZO公司近年来开发了乳酸乳球菌载体表达系统，在该载体上表达的外源基因很容易通过黏膜吸收，另外，该载体为食品级，不含有任何抗生素基因或其他有害成分(de Ruyter et al.1997;Hernandez et al.2007;Chen etal.2011)。利用该表达系统研制的疫苗，不仅具有良好的免疫效果，而且具有易吸收、无副作用的特点。
技术实现思路
根据目前国内外关于猪流行性腹泻病毒防治研究的现状和疫苗研制的最新进展，本专利技术提出一种采取目前NIZO公司提供的最新乳酸乳球菌表达载体PNZ8149 (含有乳糖基因)来装载PEDV的免疫保护性抗原S(COE)基因，并转化入缺失乳糖表达基因的乳酸乳球菌，构建重组菌，该重组菌的筛选不需要抗生素，也不含有任何对宿主细胞有害的生物因素，属于生物安全级的载体。然后将构建的重组菌免疫原接种小鼠，测定其体重增长、抗体产生及细胞免疫应答等情况，以衡量疫苗的免疫效果，本专利技术在猪流行性腹泻病毒乳酸菌载体疫苗方面有广阔的应用前景。本专利技术的技术方案如下=RT-PCR扩增获得猪流行性腹泻病毒(PEDV)主要保护性抗原COE基因序列，并将其克隆测序。根据测序结果和表达载体特点，设计表达引物，扩增PEDVC0E编码序列，并将其连接至乳酸乳球菌表达载体PNZ8149，电转化入乳酸乳球菌NZ3900细胞内。重组菌以Ing/mL乳链菌肽(Nisin)诱导,通过SDS-PAGE和Western blot分析，PEDV主要S蛋白获得了表达。表达的重组菌经不同免疫方式接种4周龄小鼠，一周后采血应用ELISA方法检测血清中的PEDV抗体及IFN- Y，评价PEDV乳酸菌疫苗刺激产生的体液免疫与细胞免疫。同时，在免疫前后测定小鼠体重，评价疫苗对小鼠生长发育的影响。结果显示各免疫组对小鼠体重增加没有负影响，且略有增加；免疫后，10倍稀释口服组小鼠刺激产生的PEDV抗体最高，同时该组刺激产生的血清中IFN-Y也最高。该PEDV乳酸菌载体口服疫苗能够刺激小鼠产生体液免疫和一定的细胞免疫。本专利技术的技术方案及意义:PEDV感染具有明显的肠道嗜性。肠道黏膜表面SlgA含量的高低直接决定疾病的发生和严重程度[2 7]。本专利技术成功地克隆了 PEDV主要保护性抗原基因C0EN，通过序列比较分析，这株PEDV主要S基因核苷酸序列同已发表的Brl/87株PEDV相应序列同源性达到99.44%，说明该基因序列比较保守，可以作为PEDV基因工程疫苗的候选基因。Tae-Jin将PEDV Brl/87株中和抗原基因(K-COE)在烟草中表达，动物试验证实有良好的抗原性(Kang et al.2005)。本专利技术针对PED免疫特点，在试验设计上以阻断肠道传染性疾病病原感染的第一道防线为目的，利用安全无毒的乳酸菌表达系统在肠道黏膜上粘附、定植和表达及传递抗原物质，因而抗原物质对黏膜的免疫刺激作用更接近于病毒的自然感染途径。因此，所产生的黏膜免疫保护效果将更为理想。本专利技术成功地克隆了 PEDV的主要保护性抗原基因，构建了 PEDV主要S蛋白乳酸乳球菌表达载体系统，表达了 PEDV主要S蛋白约20kDa的目的蛋白，ffester-blot试验表明，所表达的外源蛋白能够与PEDV免疫血清发生反应，表明重组S蛋白与PEDV天然抗原一样具有相同的反应原性。目前关于防治猪流行性腹泻的疫苗还仅限于传统的灭活疫苗，虽然对猪流行性腹泻的传播有一定的防治作用，但对于人类和动物而言，灭活疫苗中所含有的氢氧化铝佐剂等都会对宿主细胞造成一定的损害。本专利技术构建了 PEDV乳酸菌疫苗，该疫苗采用乳酸乳球菌表达载体来装载PEDV的免疫保护性抗原S(COE)基因，并转化入缺失乳糖表达基因的乳酸乳球菌，构建重组菌，该重组菌的`筛选不需要抗生素，也不含有任何对宿主细胞有害的因素，属于生物安全级的疫苗(Zamri et al.2012)。而且，乳酸菌能适应肠道环境，是肠道内的一种常在菌。乳酸菌易于通过肠道吸收，有利于产生黏膜免疫，这正好符合PEDV通过肠道感染并刺激产生黏膜免疫的特点(de Arriba et al.2002;Bermudez-Humaran etal.2011)。理论上推测，通过口服这种疫苗产生的免疫效果要好于其他途径，因此本专利技术设计了口服与注射两种途径。为了验证作为口服疫苗，乳酸菌在肠道内是否越多越好，是否会影响其他菌群的平衡，进而影响动物的生长发育等问题，为此，在本专利技术又设计了不同稀释倍数的乳酸菌口服免疫小鼠，从生长发育及刺激产生的抗体等多个方面考察该乳酸菌疫苗的免疫效果。通过测定免疫前后各组小鼠的体重，并比较各组小鼠的体重增长变化，发现各组间体重增长差异不显著，对照组与2倍稀释口服组、10倍稀释口服组小鼠的平均体重增长一致，只是10倍稀释注射组和100倍稀释注射组小鼠的平均体重增略高于其他组，但组间差异不显著。整体结果显示，口服乳酸菌疫苗不会影响小鼠的生长发育。免疫后，经过ELISA检测PEDV的特异性抗体，发现免疫组小鼠产生的PEDV抗体均显著高于对照组(P < 0.05)，而且口服组小鼠的抗体水平均高于注射组，其中10倍稀释口服组产生的抗体水平最高。该结果说明，该PEDV乳酸菌载体疫苗确实能够刺激产生PEDV特异性抗体，而且通过口服即黏膜吸收比注射即皮下吸收更容易产生高水平的抗体。因此，通过进一步证实，乳酸菌载体疫苗确实更适宜于口服免疫，而且能够刺激产生体液免疫。为全面评价PEDV乳酸菌载体疫苗的免疫效果，本专利技术又设计了检测PEDV乳酸菌载体疫苗细胞免疫的试验。IFN-Y是细胞免疫后由CD8+T细胞分泌的一种细胞因子，可以抵抗或杀死被感染的靶细胞。所以，血清中IFN-Y的水平可以在一定程度上代表细胞免疫的水平。通过ELISA方法检测了各组小鼠血清中IFN-Y的水平，发现10倍稀释口服本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种重组猪流行性腹泻病毒乳酸乳球菌的构建方法，其特征在于，包括步骤有：①利用引物序列SEQ?ID?NO.1~2，对猪流行性腹泻病毒主要保护性抗原COE基因序列进行扩增，将扩增后的产物，连接至pMD?18?T载体中；②以步骤①获得的重组载体为模板，利用引物序列SEQ?ID?NO.3~4进行PCR扩增，将PCR产物经Nco?I与Sac?I酶切、凝胶回收纯化后与经相同酶切、纯化后的载体pNZ8149连接；③将步骤②获得的重组质粒电转化入乳酸乳球菌NZ3900细胞内获得阳性重组菌。
【技术特征摘要】
1.一种重组猪流行性腹泻病毒乳酸乳球菌的构建方法，其特征在于，包括步骤有: ①利用引 物序列SEQID N0.广2，对猪流行性腹泻病毒主要保护性抗原COE基因序列进行扩增，将扩增后的产物，连接至PMD 18-T载体中； ②以步骤①获得的重组载体为模板，利用引物序列SEQID N0.3 4进行PCR扩增，将PCR产物经Nco I与Sac I酶切、凝胶回收纯化后与经相同酶切、纯化后的载体pNZ8149连接； ③将步骤②获得的重组质粒电转化入乳酸乳球菌NZ3900细胞内获得阳性重组菌。2.根据权利要求1所述的重组猪流行性腹泻病毒乳酸乳球菌的构建方法，其特征在于，所述的步骤①中，基因序列扩增条件为:94°C预变性5min，94°C变性lmin，54°C退火lmin, 72°C延伸lmin,共30个循环。3.根据权利...
【专利技术属性】
技术研发人员：高凤山，
申请(专利权)人：大连大学，
类型：发明
国别省市：
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