本发明专利技术公开了一种重组中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白及其重组中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体的制备方法，属于生物科学和运载蛋白技术领域重组中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体的制备方法包括以下步骤：NGAL抗原表位的分析；重组NGAL的合成；重组NGAL的分离纯化；制备兔抗重组NGAL蛋白抗体；收集、分离得到含有抗体的抗血清，纯化抗体，即得到抗NGAL蛋白抗体。采用该制备方法解决了天然全长蛋白制备多抗产量低的问题，同时采用本发明专利技术的制备工艺制备的抗体其特异性良好，解决了现有的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体不能全部满足用于免疫印迹、免疫组织化学实验和酶联免疫吸附实验的问题。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种重组中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白及其重组中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体的制备方法，属于生物科学和运载蛋白
重组中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体的制备方法包括以下步骤：NGAL抗原表位的分析；重组NGAL的合成；重组NGAL的分离纯化；制备兔抗重组NGAL蛋白抗体；收集、分离得到含有抗体的抗血清，纯化抗体，即得到抗NGAL蛋白抗体。采用该制备方法解决了天然全长蛋白制备多抗产量低的问题，同时采用本专利技术的制备工艺制备的抗体其特异性良好，解决了现有的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体不能全部满足用于免疫印迹、免疫组织化学实验和酶联免疫吸附实验的问题。【专利说明】
本专利技术属于生物科学和运载蛋白
，特别涉及一种重组中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白及其重组中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体的制备方法。
技术介绍
中性粒细胞明13父酶相关脂质运载蛋白(NGAL)又称人脂质运载蛋白2或曬铁蛋白，是1993年由Kjeldsen等人在中性粒细胞中首先发现的。在生理状态下，中性粒细胞、肾小管上皮细胞、肺泡巨噬细胞、支气管上皮黏液细胞等分泌少量NGAL，而脑和周围神经、结肠、子宫和卵巢、胎盘、甲状腺等组织细胞中NGAL的表达呈阴性。NGAL的生理功能尚不完全清楚，可能参与不同的生理、病理过程，涉及胚胎发育、细胞分化、肿瘤的发生发展、细胞凋亡、炎症免疫应答、脂质代谢等。在胚胎期，NGAL发挥类似生长因子的作用，参与各类组织发育、生长及分化，促进乳腺癌、食管癌等肿瘤细胞增殖。NGAL与MMP-9以二硫键形成12500bp的复合物，延长MMP的蛋白水解活性，促进MMP-9对细胞基底膜的降解，从而侵润周围基质，介导癌细胞转移。过去研究认为，NGAL促进细胞凋亡，但近年来研究发现NGAL还是一类应激蛋白，在外界有害物质刺激下，细胞分泌NGAL是一种机体自身防御机制，使组织细胞免于凋亡。NGAL还是一类新的急性期反应蛋白，作为介导铁离子像胞内运输的新型载体，通过竞争性夺取螯合物中的铁来阻止细菌对铁的吸收，从而抑制细菌生长。近年研究发现，NGAL与急性肾损伤(acute kidney in jury, AKI)及各种原因引起的CKD密切相关，是预测AKI的一个新型标记物，同时也是监测CKD进展和肾功能损害的生物学指标，从而为CKD的临床诊断与治疗检测找到了新的方法。鉴于NGAL具有诊断意义，目前有很多公司研发和生产了 NGAL体外诊断试剂盒。2005年由丹麦的BioPorto公司首先推出了 NGAL的ELISA商品检测试剂盒，可用于血清、血浆、尿液等样本中的NGAL检测。到现在已经有多家公司在国家食品药品监督管理局以及美国FDA注册了 NGAL检测试剂盒，其检测方法都是基于免疫分析方法。在这些检测产品的开发过程中抗体是试剂盒制备必不可少的原料。但是现有的这些抗体的特异性和灵敏度较差，表达蛋白的序列多选用全长序列，全长序列其表达产量低，容易导致制备多抗量不足，从而限制该检测指标试剂盒的开发及大规模的推广和应用，影响试剂盒的品质。因此研究开发高品质的抗体对试剂盒的性能及该指标检测的推广应用有着至关重要的作用。
技术实现思路
本专利技术的目的是为解决上述问题而提供了一种重组中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白以及适用于作为NGAL试剂盒的抗体的制备方法。本专利技术所采用的技术方案是:一种重组中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白，该蛋白的基因序列为序列表中SEQ ID N0.1 所述。一种要求重组中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体的制备方法，包括以下步骤:(I)重组中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白NGAL抗原表位分析:通过抗原表位分析选择目的片段用作蛋白重组表达，所述目的片段为序列表中SEQ ID N0.1所述蛋白质序列；(2)重组NGAL的合成:将选定的目的片段通过PCR扩增后插入到表达载体，然后进行转座，最后转染宿主细胞，病毒在复制的同时，目的蛋白也将得到表达；(3)重组NGAL的分离纯化:采用Ni柱纯化，包括蛋白提取和蛋白纯化；(4)制备兔抗重组NGAL抗体:用步骤(3)纯化后的重组NGAL作为抗原去免疫兔子,得到含抗重组NGAL抗体的抗血清。进一步地，所述步骤(4)后，对抗重组NGAL抗体的抗血清进行分离纯化，得到抗重组NGAL抗体干粉。进一步地，所述NGAL蛋白质序列的引物f目息为:上游引物:5’TACGGGATCCGCCCTGTTGGGGGCTCTGCATG3’(SEQ ID N0.2)下游引物:5’GCTAGTCGACGCCGTCGATACACTGGTCG3’ (SEQ ID N0.3)。优选地，所述步骤(2)中表达载体选自为pFastBacTMl、pFastBacTM ΗΤΑ、pFastBacTM HTB、pFastBacTM HTC 和 pFastBacTM Dual。优选地，所述步骤(2)中转染的宿主细胞为昆虫细胞系，所述昆虫细胞系为昆虫sf9细胞系。进一步地，所述步骤(3)中蛋白提取为:收集培养的细胞系，离心弃上清；沉淀细胞用NTA-O缓冲溶液溶解；向缓冲体系中加入溶菌酶，置冰上处理一段时间；将反应体系倒入烧杯中于冰上超声处理；后用离心机离心取上清再离心一次，后过0.22 μ m的滤膜；蛋白纯化为:取Ni柱流干，后水洗Ni柱；用EDTA溶液洗涤Ni柱；再用水洗Ni柱；用NTA-O缓冲溶液洗涤Ni柱；后用NiS04洗涤Ni柱，流干；再用NTA-O缓冲溶液洗涤Ni柱至流出液与NTA-O缓冲溶液pH值相同；以lmL/min速度上样；用NTA-O缓冲溶液洗涤至G250不变蓝为止；后用20mM、60mM、200mM和500mM咪唑溶液洗柱子，直至检测G250不变蓝为止，分别收集流出液体，跑胶分析溶液中重组NGAL纯度。进一步地，所述步骤(4)兔抗重组NGAL抗体的制备为:取重组NGAL与等体积的完全弗氏佐剂充分乳化后在兔背部皮下注射，注射量为500 μ g/只，首次免疫注射后第2周进行一次加强免疫注射，以后每隔两周加强免疫注射一次，每次加强免疫注射剂量与首次免疫注射剂量相同，加强免疫时取重组NGAL与等体积的不完全弗氏佐剂充分乳化后在兔背部皮下注射，注射量为500 μ g/只，静脉采血，得到含抗重组NGAL抗体的抗血清。优选地，所述步骤(4)可以采用羊来制备羊抗重组NGAL抗体。进一步地，所述抗重组NGAL抗体的抗血清进行分离纯化为:1)制备NGAL亲和层析柱:将NGAL蛋白与压积CNBr-Sepharose4B混合,依次经过交联、清洗、封闭、再次清洗、装柱、平衡，得到NGAL亲和层析柱；2)亲和层析:将NGAL抗体溶液通过I)所制备的亲和层析柱，去除非特异性吸附后进行解吸，分段收集解吸液；3)抗体获取:将2)收集解吸液，透析，冷冻干燥，得到NGAL抗体干粉。本专利技术具有以下优点:本专利技术通过对NGAL的免疫原性分析，把两端没有免疫原性的位点去掉，同时采用昆虫表达系统对选定的序列进行表达，重组NGAL的表达量会大幅度提闻，同时制备的多抗量充足，适合用做诊断试剂原料的开发。同时，采用昆虫细胞系表达重组NGAL，相较于大肠杆菌表达系统而言，昆虫细胞系表达系统可以对重组蛋本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种重组中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白，其特征在于，该蛋白的基因序列为SEQ?ID?NO.1所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：华权高，刘瑾，易汪雪，闫彩霞，马峰，沈鹤霄，舒芹，
申请(专利权)人：武汉华美生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：
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