公开了用于产生融合蛋白和肽的方法和系统。还提供使用所述方法产生的融合蛋白和肽。还提供使用根据本公开产生的融合蛋白和肽的方法。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利说明】含脂质运载蛋白融合伴侣 关于联邦资助研究的声明 本专利技术是在美国政府的支撑下依据国家卫生研究院合同号R01CA13549UNIHR0I AI059543、AI094419 和AI097786 而完成。[000引专利技术背景 在药物发现方面的努力继续使用巨大的技术和财政资源来鉴别和开发新的和适 用的药物。不幸的是，发现新药一直是困难的。例如，开发损伤性小（更确切地说祀向癌 症）的疗法是有必要的。但即使研究了数十年，科学家仍在努力鉴别具有医药和癌症祀向 性质的正确混合的治疗化合物，其不仅降低了治疗化合物可充当治疗策略的可能性，而且 对成功的手术切除法产生需要。 已经研究了广泛的多种类型的化合物并且将其从事于众多治疗目的。例如，小的 化学分子和较大生物制剂（例如抗体）已经用于大量治疗应用中，取得了不同的成功。也 已经显示一些较小的肤例如因其天然的效力而适用作药物。 缺少快速并有效地制造用于临床应用的肤和蛋白质的方法已经限制了可W充当 治疗化合物的肤和蛋白质的发现。已经在细菌表达系统（例如大肠杆菌巧.Coli)基因表 达）中探索了产生肤、蛋白质结构域或蛋白质与不同蛋白质的融合物W增强肤和蛋白质的 产生。然而，细菌蛋白表达系统一般因蛋白质折叠效率误差而受限。因此，仍需要可快速并 有效地产生肤、蛋白质结构域和蛋白质的方法。 专利技术概述 本专利技术设及产生隧铁蛋白（siderocalin)融合蛋白的方法。在各个方面，本专利技术 设及根据那些方法产生的融合蛋白。在某些方面，融合蛋白被裂解，从而产生根据本公开的 肤。本专利技术还设及产生融合蛋白的方法，所述方法包括在细胞中表达融合蛋白，所述融合蛋 白包含肤或蛋白质结构域和脂质运载蛋白，从而产生融合蛋白。在一些实施方案中，本专利技术 还设及一种产生肤的方法，所述方法包括：在细胞中表达包含肤和脂质运载蛋白的融合蛋 白；W及从脂质运载蛋白分离肤，从而产生肤。 在一些实施方案中，本专利技术设及融合蛋白的组合物，所述组合物包含：肤或蛋白质 结构域；W及脂质运载蛋白。在一些实施方案中，本专利技术还设及一种包含肤文库的组合物， 所述肤文库还包含多种缺乏至少一个天然赖氨酸残基的肤。本专利技术还设及一种组合物，其 包含：包含肤和脂质运载蛋白的融合蛋白。 W引用的方式并入 本说明书中提及的所有出版物、专利及专利申请都W引用的方式并入本文中，其 引用程度如同每一个别出版物、专利或专利申请被特定地且个别地表明W引用的方式被并 入一样。 附图简述 在随附权利要求书中特别地示出了本专利技术的新颖特征。将通过参考W下阐述说明 性实施方案（其中利用了本专利技术的原理）的详细描述，W及随附图式来获得对本专利技术的特 征和优势的更好理解，在所述图式中： 图1提供了示出根据本专利技术的一个实施方案的多种支架的凝胶图像。 图2示出了根据本专利技术的一个实施方案产生肤文库的实例方法。 图3描绘了根据本专利技术的一个实施方案可用W制备打结素（knottin)(例如气泡 蛋白）的实例融合系统。 图4示出了根据本专利技术的一个实施方案使用质谱对大的肤文库的分析。 图5示出了根据本专利技术的一个实施方案使用隧铁蛋白融合物W表达打结素变体 的实例方法。 图6描绘了根据本专利技术的实施方案对表达性打结素支架的SDS-PAGE分析。 图7提供了根据本专利技术的一个实施方案的汇集文库产生的示意图。图7B示出了 图7A的透视图。 图8描述了根据本专利技术的一个实施方案来自克隆的打结素文库的代表性测序数 据。 图9示出了根据本专利技术的实施方案对3000个成员的打结素文库的SDS-PAGE分 析。 图10示出了根据本公开的一个方面制造打结素的一般过程。 图11示出了根据本公开的一个方面制造打结素的一般过程。图12示出了根据本公开的一个方面制造打结素的一般过程。根据运个方面，裂解 出现在弗林蛋白酶-打结素交界面。 图13示出了根据本公开的一个方面用代达罗斯系统值aedalussystem)制备的 打结素的实例和相应的SDSPAGE分析。代达罗斯系统描述于BandaranayakeA.化等， NucleicAcidsRes. (2011)39(21) :el43 中。 图14示出了来自18个物种的Sen序列的比对。所述比对示出了在18个具有可 识别的直系同源体的物种之间高水平的序列保守性。星号位置是用于配体结合的可能位 点。Correnti，C.和Strong，R.K. (2013)'Ironsequestrationinimmunity'在Metals inCelIs中;Encvclopedi曰ofInorg曰nic曰ndBioinorg曰nicChemistry. (Culotta，V.和 Scott,R.A.，编.）JohnWiley&Sons，第：M9-59 页。 图15描绘了根据本公开的一个方面的超稳定Sen的3D模型。在运种形式的Sen 中，将第二个二硫键工程化W保护N末端并且提高热稳定性。 图16示出了可用于本公开的各个方面的一般Sen融合物的示意图。除去天然信 号肤并且增加外源性sFLAG和HIS标签W帮助纯化。运些修饰任选地存在于本公开的各个 方面。 图17描绘了根据本公开的一个方面轻链抗体与Sen的融合物和相应的SDSPAGE 分析的示意图。 图18示出了根据本公开的一个方面比较Sen与胞质酶HM0X1的融合物的表达在 裂解前后的SDSPAGE分析。 图19描绘了根据本公开的一个方面Sen与细胞质病毒蛋白质Adv2的融合物的表 达W及相应的SDSPAGE分析。 图20描绘了根据本公开的一个方面Sen与细胞外病毒糖蛋白HIV甜120的融合 物的表达W及相应的SDSPAGE分析。 图21描绘了根据本公开的一个方面Sen与打结素蛋白欧前胡素的融合物的表达 W及相应的SDSPAGE分析。 图22描绘了根据本公开的一个方面Sen与细胞外酪氨酸激酶受体R0R1的小的亚 结构域（即=环域）的融合物的表达W及相应的SDSPAGE分析。 图23描绘了根据本公开的一个方面Sen与屯聚体W及=聚体亚结构域的融合物 的表达W及相应的SDSPAGE分析。 图24描绘了根据本公开的一个方面ExFABP与打结素的融合物的表达W及相应 SDSPAGE分析。ExFABP是另一功能性Sen。根据本公开，运种构建体可用于周质细菌系统 W分泌多种客户蛋白。 图25描绘了具有化配体的Sen的晶体结构。 图26描绘了捕获的巧光铁载体。左框描绘了蛋白质铁载体络合物的尺寸排阻纯 化。右框是不意图。 专利技术详述 本公开的方法和系统设及融合蛋白和其制造方法。根据某些方面，使用本专利技术的 方法产生的肤可用作药物发现平台的组分。在一些方面，所述方法设及产生具有潜在治疗 价值的第一蛋白质或肤与第二蛋白质的融合物，W使第二蛋白质增强表达系统对第一蛋白 质的产生和折叠。在一些方面，在表达和纯化融合蛋白之后，融合蛋白裂解，W使第一蛋白 质和第二蛋白质为独立蛋白质。在一些方面，第二蛋白质可为脂质运载蛋白。例如，第二蛋 白质可为特异性脂质运载蛋白，如隧铁蛋白。 缀合物 在一些方面，本专利技术包括如本文所述的融合蛋白、肤或其缀合物。例如，一些或所 有融合蛋白或肤可缀合于选择W修饰肤性质的部分。 在某些方面，本专利技术包括在N末端缀合于疏水性（本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种产生融合蛋白的方法，所述方法包括在细胞中表达融合蛋白，所述融合蛋白包含肽或蛋白质结构域和脂质运载蛋白，从而产生所述融合蛋白。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：J·奥尔森，C·梅林，C·科伦提，R·斯特朗，
申请(专利权)人：弗莱德哈钦森癌症研究中心，
类型：发明
国别省市：美国;US
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